貴州省結直腸癌Kras基因突變分析及臨床意義

梁躍 李光學 馬慶慶

摘 要 目的：探討結直腸癌組織Kras基因突變情況及其與部分臨床病理特征的關系。方法：采用熒光定量PCR法檢測貴州省60例結直腸癌組織中Kras基因突變情況。結果：Kras基因突變率為31.67%，以第12密碼子突變為主；突變類型6種，G12D突變率最高；Kras基因突變與結直腸癌患者年齡、性別及腫瘤部位無明顯相關性，與吸煙、飲酒也無關聯性。結論：結直腸癌臨床檢測中對Kras基因突變進行分子檢測，可正確指導臨床用藥和科學選擇治療方案，從而進行更有效的靶向治療。

關鍵詞 結直腸癌；Kras基因；基因突變

結直腸癌（CRC）是世界范圍內的常見惡性腫瘤之一，雖然以手術切除、化學藥物治療和放射治療為主的綜合治療取得了一定進展，但CRC的治療仍然面臨巨大挑戰。目前化療是CRC術后最主要的治療手段之一，而部分患者卻療效甚微或者無效，有些患者甚至產生不良反應，導致用藥失敗。據統計，CRC化療的有效率僅30%，有多達700/0的CRC患者對化療藥物無效。隨著靶向治療藥物表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑西妥昔單抗和帕尼單抗的問世，CRC的治療進入了靶向治療時代。Kras是EGFR信號轉導通路中一個重要的下游調控基因，突變型的Kras無需ECFR接收信號，能夠自動活化該通路并啟動下游信號的轉導，只有野生型Kras基因患者才對抗EGFR單克隆抗體治療有效，而突變型的患者無效。因此，Kras基因突變的檢測與分析對CRC患者治療方案的選擇，尤其在選擇西妥昔單抗等靶向治療藥物上具有重要意義。該研究分析2015年10月-2017年6月60例貴州省內CRC患者病灶組織的Kras基因突變情況，探討其臨床意義，為個體化靶向治療CRC提供基礎依據。

資料與方法

選擇2015年10月-2017年6月間貴州航天醫院收存的貴州地區CRC石蠟包埋標本60例，男27例，女33例；年齡20～72歲，平均（46.07±1.58）歲。記錄已確診CRC患者的年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓等一般信息。

試劑與儀器設備：FFPE樣品DNA分離試劑盒（艾德，中國），人類KRAS基因7種突變檢測試劑盒（艾德，中國），Nanodropl000微量核酸測定儀，ABI7500熒光定量PCR儀等。

方法：①提取石蠟切片DNA：提取2～5片10μm的組織切片，利用二甲苯脫蠟，經離心處理后，取上清液加入lmL無水乙醇，震蕩離心后靜置沉淀，使用廈門艾德生物醫藥科技有限公司的FFPE樣品DNA分離試劑盒，按照說明書步驟進行組織切片DNA的提取。用DNA微量分光光度計測定所提DNA的濃度及純度（OD260/OD280）。②PCR擴增：將所提DNA進行稀釋，以DNA為模板，使用人類KRAS基因7種突變檢測試劑盒，在熒光定量PCR儀中進行實時熒光定量PCR擴增，記錄Kras基因突變情況。

統計學方法：采用SPSS 20.0分析，計量資料采用（x±s）表示，采用t檢驗；計數資料采用率（%）表示，采用X2檢驗，P< 0.05表示差異有統計學意義。

結果

Kras基因突變情況：貴州省60份組織中，Kras基因突變19例（31.67%），其余均為野生型，其中第12位密碼子突變16例（84.21%），第13位密碼子突變3例（15.79%），未檢出第12、13位密碼子同時突變。貴州省CRC患者Kras基因突變類型顯示，本研究Kras基因突變類型有6種，主要為第12密碼子突變，約84.21%（16/19），其中G12D突變最高，約42.ll%（8/19），見表l。

Kras基因突變與年齡、性別及腫瘤部位的關系：Kras基因突變和CRC患者的年齡、性別及腫瘤部位無顯著相關性（P>0.05），見表2。

Kras基因突變與吸煙、飲酒的關系：納入的60例患者中，吸煙12例，發生Kras基因突變l例，不吸煙48例，發生Kras基因突變15例，兩者間差異無統計學意義（P=0.890）；飲酒16例，發生Kras基因突變5例，不飲酒44例，發生Kras基因突變14例，兩者間差異無統計學意義（P=0.967）。

討論

EGFR在許多實體瘤組織中高表達，CRC高居第2位，且EGFR陽性率越高，腫瘤的惡性程度也會越高、侵襲力越強、預后越差同。近年研究顯示，靶向藥物西妥昔單抗治療的有效性受其Kras基因狀態的影響。Kras基因是EGFR信號轉導通路中一個重要的下游調控基因，突變型的Kras無需ECFR接收信號，能夠自動活化該通路并啟動下游信號的轉導從而也促進CRC的發生、發展。近年大量數據已表明，抗EGFR單克隆抗體藥物在野生型Kras基因CRC患者中有較好的療效，Kras基因突變被認為是對抗ECFR單克隆抗體藥耐藥的獨立影響因素。國內外報道Kras基因突變率30%～40%，且常見突變發生在2號外顯子的第12、13位密碼子，常見突變類型包括C12D、C12V、G12A、G12S、G12C、G13D，可發生雙突變或者三突變。本研究共檢測出19例Kras基因突變，突變率31.67%；突變主要發生在第12位密碼子上（16例，84.21%），未檢測到雙突變或三突變；在6種突變類型中G12D[8例（42.1 1%）]、G12V[4例（21.05%）]和C13D[3例（15.790/0）]突變率較高，與國內外已報道數據基本一致。這表明貴州省CRC患者中也存在較高的Kras基因突變率，突變患者將不能從抗ECFR的靶向治療中獲益，因此建議CRC患者在用靶向治療藥物（如西妥昔單抗等）之前應先檢測Kras基因突變情況，正確選擇抗EGFR單抗藥，從而進行最有效的分子靶向治療。

目前Kras基因突變與CRC患者臨床病理特征之間的關系研究尚未得出一致結果。此前有報道分析966例中國CRC患者Kras基因突變，認為Kras基因在右半結腸癌女性患者中的突變率高，且與患者年齡也有關系。也有研究報道，Kras基因突變更易發生于女性患者，而與其他病理特征無相關性。本研究發現貴州省CRC患者Kras基因突變與患者性別、年齡及腫瘤部位并無明顯相關性。Kras基因突變與病理特征之間關系的研究結果各有差異，可能與檢測方法的選擇不同、樣本量懸殊及地區差異等因素有關。另外研究未發現CRC患者Kras基因突變與吸煙、飲酒之間存在相關性，提示CRC患者Kras基因突變可能不受吸煙與飲酒因素的影響，鑒于病例數較少，仍需進一步擴增病例進行探討。