結直腸息肉和結直腸癌中CD24和Lgr5的表達

薛偉彩 王建立 許建成 吳春曉 高記華

(河北省中醫院肛腸科，河北 石家莊 050011)

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一〔1〕,結直腸瘤性息肉是直腸癌的重要癌前病變，認為93%的結直腸腺癌由腺瘤惡變而來〔2〕。腺瘤性息肉的大小、形態、數量及病理類型是其癌變的重要因素〔3,4〕。息肉越大，癌變率越高，特別是>2 cm的腺瘤性息肉的惡變率高達50%。腺瘤的數目增多，其癌變率相應增加，廣基息肉更易癌變，而息肉的病理類型也是其重要的癌變因素，絨毛狀腺瘤的癌變率可高達30%以上。腺瘤切除后結直腸癌的發生率明顯降低。一般情況下，良性腺瘤向癌發展的過程是一個長期的過程，歷時5～10年〔5〕，這就為臨床預防、早期診斷和早期治療結直腸癌提供了機會和可能。目前關于結直腸息肉發生癌變的具體機制尚不清楚。為何臨床上發現絨毛狀腺瘤較管狀腺瘤性息肉癌變概率高，而炎性及增生性息肉基本不癌變也沒有明確的原因。近年研究證實，腸道中正常存在的干細胞的功能紊亂，如自我更新、克隆增殖、分化和凋亡失去平衡，不但與腸息肉和直腸結腸癌的發生有直接或者間接的關系，而且很有可能是腫瘤細胞的最早起源〔6〕。因此，從細胞和分子生物學水平上研究腸息肉發生規律及原因，對于腸息肉相關腫瘤的早期診斷、結直腸癌發生風險預測及尋找新的治療方法和新的靶點具有非常重要的意義。到目前為止，已經發現了大量與腫瘤干細胞相關的表面標志物，在這些標志物中與大腸癌相關的較為引人注意的包括CD24和富含亮氨酸重復系列G蛋白耦聯受體(Lgr)5。本研究探討結直腸癌、結直腸息肉中CD24、Lgr5的表達。

1 材料和方法

1.1材料 本研究100例結直腸息肉和結直腸腺癌標本均來自河北省中醫院內鏡室2012年1月至2013年12月行結腸鏡檢查或治療的病例。其中，炎性增生性息肉、管狀腺瘤性息肉、絨毛狀腺瘤性息肉各20例和腺癌40例，其異型增生程度分別為無異型增生22例、低級別上皮內瘤變28例、高級別上皮內瘤變10例。直徑<1.0 cm息肉27例，直徑1.0～2.0 cm息肉25例，直徑>2.0 cm息肉8例。全部100例患者男66例，女34例，年齡26～79歲，<40歲26例，≥40歲74例。選擇同期腸鏡下活檢，病理證實正常的結直腸黏膜20例為對照組。通過免疫組化染色，觀察患者CD24和Lgr5的表達情況，所有病理切片由兩名副主任病理科醫師獨立閱片后統計分析。

1.2方法 所有標本在10%中性甲醛溶液中固定，普通石蠟包埋。HE染色：首先將各種類型組織連續切片，厚度4 μm，將4 μm石蠟切片進行二甲苯脫蠟、酒精水合，用蘇木素染核5 min，自來水沖洗，氨水反藍1 min，自來水沖洗，用伊紅染胞質3 min，自來水沖洗，95%酒精分化30 s，最后用二甲苯透明15～20 min后封片，在顯微鏡下觀察攝片。免疫組化染色，先做預實驗，根據染色效果確定CD24第一抗體最佳濃度為1∶200;Lgr5第一抗體最佳濃度為1∶100，磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作空白對照，已知陽性片作陽性對照。具體步驟：①脫蠟脫水處理:石蠟切片依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各10 min,而后放入無水乙醇、95%乙醇、75%乙醇各5 min,PBS浸泡10 min;②去除內源性過氧化物酶活性:將玻片放入3%H2O2:溶液10 min,PBS沖洗3次，每次5 min;③抗原修復:將切片置入pH6.0的SSC緩沖液容器中，700 W微波加熱10 min，修復抗原。冷卻至室溫后用PBS沖洗3次，每次3 min；④加一抗:分別滴加CD24,Lgr5抗體，然后置于4℃冰箱孵育24 h,37℃溫箱復溫15 min后，用PBS緩沖液沖洗3次，每次3 min;⑤加二抗:方法同前；⑥二氨基聯苯胺(DAB)顯色:采用1∶50顯色，于鏡下觀察染色程度。染色滿意后封片；⑦蘇木素復染細胞核，逆梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果并攝片。

1.3免疫組化染色結果判斷 光鏡下觀察組織切片的顯色反應，CD24的陽性表達以腺體細胞膜染色為主，胞質可有少量染色，呈黃色或棕黃色顆粒狀為陽性染色;Lgr5的表達以胞質呈紅色或紫色為陽性染色。高倍鏡下(×400)每張切片隨機選擇5個視野，進行視野內腺體細胞計數，并計算陽性細胞所占比例。腺體細胞無著色為(-);<25%的細胞著色(+);25%～50%的細胞著色為();>50%的細胞著色為()。

1.4統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗，兩變量之間的關系采用相關性分析。

2 結 果

2.1CD24和Lgr5的表達結果 CD24陽性的表達主要定位于細胞膜，陽性反應為細胞膜呈黃色或棕黃色。在正常腸黏膜、炎性息肉未見CD24陽性表達，但在腺瘤組和腺癌組中有不同程度表達，且多為強陽性。CD24陽性表達與組織類型的關系:在非腺瘤、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、腺癌序列中，CD24陽性率逐漸增高，兩變量相關分析顯示CD24陽性率與息肉病理類型有相關性(r=0.627,P<0.01)。正常結直腸黏膜與炎性息肉之間，管狀腺瘤與絨毛狀腺瘤之間CD24陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。但正常結直腸黏膜、炎性息肉與腺瘤組(包括管狀腺瘤和絨毛狀腺瘤);腺瘤組與腺癌組之間比較CD24表達差異有統計學意義(P<0.01)。Lgr5陽性表達主要定位于細胞質中，以胞質呈紅色或紫色為陽性染色。正常黏膜細胞核和細胞膜幾乎不著色，但在腺瘤和腺癌中，腺體細胞膜也有一定的表達。在正常腸黏膜未見Lgr5表達，但在炎性息肉、腺瘤組和腺癌組有不同程度表達，而在腺瘤組和腺癌組多為強陽性(～)。在正常結直腸黏膜、炎性息肉、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、腺癌序列中，Lgr5表達呈逐漸增高趨勢，兩變量相關分析顯示Lgr5陽性率與息肉病理類型有相關性(r=0.563,P<0.05)。正常結直腸黏膜與炎性息肉之間、管狀腺瘤與絨毛狀腺瘤之間及腺瘤組(包括管狀腺瘤和絨毛狀腺瘤)與腺癌組比較，Lgr5陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。但正常結直腸黏膜與腺瘤組之間、炎性息肉組與腺瘤組以及正常結直腸黏膜和炎性息肉與腺癌組之間比較Lgr5陽性率差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 CD24和Lgr5在結直腸各種組織中的表達〔n(%)〕

與腺癌組比較：1)P<0.05；與管狀腺瘤組及絨毛狀腺瘤組比較：2)P<0.05

2.2CD24和Lgr5表達與息肉大小的關系 CD24陽性率隨著息肉直徑的逐漸增加而遞增，兩變量相關分析顯示CD24陽性率與息肉大小有相關性(r=0.345,P<0.05)。直徑<1.0 cm與直徑>2.0 cm息肉中CD24陽性率差異有統計學意義(χ2=6.366,P<0.05);直徑<1.0 cm與直徑1.0～2.0 cm息肉中CD24陽性率差異有統計學意義(χ2=4.876,P<0.05);而直徑1.0～2.0 cm與直徑>2.0 cm息肉中，CD24陽性率差異無統計學意義(χ2=0.916，P>0.05)。Lgr5陽性率隨著息肉直徑的逐漸增加而遞增，但兩變量相關分析顯示Lgr5陽性率與息肉大小有相關性(r=0.419,P<0.01)。直徑<1.0 cm與直徑1.0～2.0 cm息肉比較Lgr5陽性率差異有統計學意義(χ2=9.816,P<0.01);直徑<1.0 cm與直徑>2.0 cm的息肉比較Lgr5陽性率差異有統計學意義(χ2=6.291,P<0.05);而直徑1.0～2.0 cm與直徑>2.0 cm息肉比較，Lgr5陽性率差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 CD24和Lgr5在結直腸息肉中的表達〔n(%)〕

與<1.0 cm組比較：1)P<0.05

2.3CD24和Lgr5表達與結直腸息肉異型增生的關系 CD24陽性率隨著無異型增生、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變及腺癌組逐漸遞增，兩變量相關分析顯示CD24陽性率與異型增生程度有相關性(r=0.579,P<0.05)。無異型增生與低級別上皮內瘤變之間CD24陽性率比較差異有統計學意義(χ2=13.608,P<0.01)，低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變組CD24陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)，但低級別上皮內瘤變與腺癌組差異有統計學意義(χ2=9.692,P<0.01)。高級別上皮內瘤變與腺癌組之間CD24陽性率差異無統計學意義(P>0.05)。Lgr5陽性率隨著無異型增生、低級別上皮內瘤變、高級別上皮內瘤變及腺癌組逐漸增加，但兩變量相關分析顯示Lgr5陽性率與異型增生程度呈相關性(r=0.524，P<0.01)。但無異型增生組與低級別上皮內瘤變組、高級別上皮內瘤變組和腺癌組之間兩兩比較，Lgr5陽性率差異有統計學意義(P<0.01)，低級別上皮內瘤變組、高級別上皮內瘤變組和腺癌組之間兩兩比較Lgr5陽性率比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 CD24和Lgr5表達與結直腸息肉異型增生的關系〔n(%)〕

與低級別上皮內瘤變組比較：1)P<0.05；與無異型增生組比較：2)P<0.05

2.4CD24和Lgr5表達與年齡、性別的關系 CD24陽性率在<40歲和≥40歲之間差異有統計學意義(χ2=5.899,P<0.05),在男性和女性兩組比較差異無統計學意義(χ2=0.304，P>0.05)。Lgr5陽性率在<40歲和≥40歲之間比較差異無統計學意義(χ2=0.273，P>0.05)，在男性和女性兩組之間比較差異無統計學意義(χ2=1.027,P>0.05)，見表4。

表4 CD24和Lgr5表達與年齡、性別的關系〔n(%)〕

與<40歲組比較：1)P<0.05

3 討 論

研究證明結直腸息肉被切除后結直腸癌的發病率降低了76%～90%〔7〕。隨著對腫瘤細胞研究的不斷深入，越來越多的研究者提出腫瘤形成的干細胞起源學說。在惡性腫瘤組織中并非所有腫瘤細胞都具有惡性特征，僅少量腫瘤細胞具有無限增殖、自我更新和多向分化潛能，在惡性腫瘤的發展過程中起著干細胞的作用，可以形成各種分化程度的腫瘤細胞和非腫瘤細胞，是維持惡性腫瘤組織形成、轉移和復發及腫瘤耐藥的根源，它們在惡性腫瘤的發生、發展和轉移過程中起著決定性的作用，這類細胞被稱之為腫瘤干細胞。通過特異性表面標志，可以對腫瘤干細胞進行分離純化，這些腫瘤干細胞的標志物有CD44、CD24、 CD133、 CD166、 EpCAM和Lgr5等〔8，9〕。因此通過檢測某些有價值的腫瘤干細胞表面標志物，對結直腸癌進行早期預測、診斷和早期治療。

CD24是一種低分子量高度糖基化的黏蛋白樣的黏附分子，它通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)而錨定于細胞膜糖脂富集區域上〔10〕。研究發現，在人類許多惡性腫瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌和胰腺癌及子宮惡性腫瘤等組織中均有高表達〔11，12〕。最近發現CD24在結直腸癌中有表達，并認為是在結直腸癌多級演進過程中的早期階段，它對調節腫瘤細胞生長、增殖、侵襲及淋巴結和遠處轉移等具有重要作用，而且CD24的高表達與腫瘤的惡性傾向密切相關，可能對患者的臨床預后有一定的影響〔13，14〕。本研究中CD24表達增強發生在結直腸癌腫瘤形成的早期階段，可能參與結直腸癌的腫瘤形成過程。

Lgr5為跨膜糖蛋白，屬于糖蛋白激素類受體，最初發現其在胎盤、骨骼肌、腦組織和脊髓中有表達，控制著胎盤組織的分化和生長〔15〕。后來發現其在卵巢癌、肝癌、基底細胞癌和結直腸癌中高表達〔16，17〕。Barker等〔8〕發現Lgr5表達在腸道隱窩基底部，并提出了其作為腸道腫瘤干細胞標志物的理論。近年研究表明，Lgr5可能參與了結直腸癌等腫瘤發生、發展，其表達可能是結直腸癌等腫瘤發生的重要早期指標〔18,19〕。本研究進一步證實Lgr5的陽性表達增強可能是結直腸癌的早期事件。

2006年美國胃腸內鏡學會提出的最新指南將大腸癌篩查的年齡定為50歲，而國內有學者將大腸癌篩查的年齡定為40歲，認為>40歲是息肉癌變的一個危險因素〔20〕。孫艷等〔21〕研究提示結直腸癌組織Lgr5 mRNA在不同性別和年齡間的表達無統計學差異，本實驗的結果與之相符，由此可提示雖然CD24和Lgr5的表達都可能參與結直腸癌的形成過程，都是結直腸息肉癌變的有價值指標和結直腸癌的重要的早期指標，但CD24表達與年齡因素有關，而Lgr5表達與年齡因素無關。

總之，在非腺瘤、管狀腺瘤、絨毛狀腺瘤、腺癌序列中，CD24和Lgr5的表達逐漸增加。隨著結直腸息肉大小的增加，CD24和Lgr5的表達逐漸遞增。CD24表達受年齡的影響，而Lgr5的表達則與年齡無關，所以推測Lgr5表達的檢測較CD24可能是更好的早期指標。CD24和Lgr5的表達與性別無關。CD24和Lgr5都是結直腸息肉惡變的重要參考指標，對它們的檢測可以為結直腸癌的早期診斷提供一定的幫助。

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