石蠟切片中卵巢癌基因1第2外顯子PCR-SSCP檢測法建立

苗小艷 石 敏 李 巖 趙文嬌 孔繁斗 趙春艷

(大連醫科大學檢驗醫學院，遼寧 大連 116044)

卵巢癌基因(OVCA)1是與卵巢癌、乳腺癌等有關的腫瘤抑制基因〔1～5〕，定位于人染色體17p13.3〔1〕，該區域在卵巢癌中發生雜合性缺失(LOH)的頻率高達50%～86%〔2,6～9〕,研究顯示該基因缺失可能在卵巢癌早期階段即存在〔8〕。但關于OVCA1的生物學功能及其在腫瘤發生發展中的作用和機制目前尚不清楚。研究發現乳腺癌中OVCA1基因多個外顯子存在堿基突變〔3〕，本研究擬建立石蠟包埋切片標本OVCA1第2外顯子的聚合酶鏈反應(PCR)單鏈構象多態性(SSCP)檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料 石蠟包埋組織標本來自大連醫科大學附屬第一醫院2009年經病理確診的卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌標本3例、卵巢漿液性乳頭狀囊腺瘤4例和正常卵巢組織3例。石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa DEXPATTM)、DNA marker和PyrobestTMDNA聚合酶試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，其余試劑為國產分析純。

1.2基因組DNA的提取 按試劑盒說明進行操作：將2枚10 μm石蠟包埋組織切片放入1.5 ml Ep管中，加入DEXPAT試劑0.5 ml。100 ℃加熱10 min，12 000 r/min 4 ℃離心10 min。將含有DNA水層移入另一新Ep管中作為PCR反應模板。PCR擴增 引物序列：上游5′-TTCCATCTCAATCTGGCTTC-3′，下游5′-CATCTGGGCCAGGCAAC-3′。擴增條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，59℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環；72℃延伸2 min。3%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段。

1.3SSCP檢測 5 μl DNA樣品加入等量SSCP上樣緩沖液〔10 ml上樣緩沖液中含有去離子甲酰胺9.4 ml，0.5 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)0.4 ml，5% 溴酚藍0.2 ml〕，混勻，98℃變性10 min，立即置于-20℃冰浴10 min。配制8%非變性聚丙烯酰胺凝膠，將上述樣品上樣、200 V、4℃電泳。電泳結束后，取出凝膠，置于固定液(含40%乙醇、10%醋酸)中固定30 min，去離子水漂洗5 min，重復3次。加入銀染溶液(0.012 mol/L硝酸銀)染色20 min，去離子水洗滌5 s，重復3次。加入顯色劑(1.5%NaOH、0.02%甲醛)輕輕晃動，顯色30 s后，顯色液變黃或出現棕色顆粒。更換顯色液，輕輕搖動，5 min后將凝膠移入終止液(10%醋酸)終止顯色反應。取出凝膠，吸水紙吸干表面水分，拍照記錄結果。

2 結 果

2.1OVCA1基因第2外顯子的PCR擴增結果 以提取自卵巢組織石蠟切片的基因組DNA為模板進行PCR擴增，3%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增片段(271 bp)，可見PCR擴增產物成單一條帶，條帶位置正確。見圖1。

2.2OVCA1第2外顯子的SSCP檢測結果 凝膠上可見3條清晰條帶。10例卵巢組織標本中，DNA條帶數目及位置相同。見圖2。

1～3為卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌，4～7為卵巢漿液性乳頭狀囊腺瘤，8～10為正常卵巢組織，M為DL500 DNA marker；下圖同圖1 OVCA1第2號外顯子的PCR擴增片段

圖2 OVCA1基因第2號外顯子的SSCP檢測

3 討 論

卵巢癌是婦科惡性腫瘤中死亡率最高的疾病，具有發病隱匿、早期診斷困難、預后差等臨床特點，絕大部分卵巢癌患者就診時已屬晚期，5年存活率僅為30%〔10〕，而早期卵巢癌的5年存活率可高達90%以上〔10,11〕。

抑癌基因缺失或突變導致功能喪失是腫瘤發生的重要機制。OVCA1是一個由12個外顯子組成、編碼443個氨基酸的抑癌基因〔2,6～9〕。有研究表明過表達OVCA1基因可抑制細胞增殖并阻滯于G1期〔3〕。敲除小鼠OVCA1基因后，腫瘤發生率明顯增加〔4〕。過表達OVCA1可通過p16途徑抑制卵巢癌細胞增殖〔12〕，并具有抑制卵巢癌細胞遷移和侵襲的作用〔13〕。研究還發現在卵巢癌、乳腺癌等腫瘤中存在OVCA1基因多個外顯子突變〔3〕，但這種突變與卵巢癌發生發展的關系尚不清楚。

PCR-SSOP技術為點突變的檢測手段〔14〕，具有簡便、快速、靈敏度高、無需特殊儀器設備、價格低廉、無需已知突變位點及序列等優點，被廣泛用于點突變的初步篩選〔14,15〕。本研究結果表明該PCR擴增條件適合OVCA1第2外顯子擴增；本文所建立的SSCP電泳及染色條件適合用于OVCA1基因第2外顯子單鏈構象的檢測。本研究顯示，所測3例卵巢癌和4例卵巢良性腫瘤中未檢出點突變。

4 參考文獻

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