缺血預處理對大鼠缺血腦組織p-p38MAPK、Fas、FasL蛋白表達的影響

馬 飛 鄒玉安 薛 茜 張 力

(河北北方學院，河北 張家口 075000)

腦缺血預處理(CIP)可提高大鼠腦組織對缺血再灌注損傷的耐受，保護神經元功能〔1，2〕，而其機制未闡明。CIP可能誘導了抗凋亡機制,通過抑制神經元的凋亡對抗缺血再灌注損傷〔3,4〕。p38MAPK是MAPK家族中的重要成員，激活后的p38MAPK參與對腦缺血后神經細胞凋亡的調控〔5〕；腦缺血損傷后Fas、FasL表達亦明顯增高〔6〕，兩者都是腦缺血再灌注損傷重要通路。本研究通過觀察CIP后p-p38MAPK、Fas、FasL蛋白在大鼠腦組織中的表達變化,探討CIP對p38MAPK及其下游的Fas/FasL系統的影響及其誘導缺血性耐受的可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 SPF級健康雄性SD大鼠90只,體重250～280 g，購自北京華阜康生物科技有限公司〔實驗動物許可證：SCXK(京)2014-0004〕。將大鼠隨機分為模型組、缺血預處理組及假手術組,每組30只；各組再按觀察時間點分為6 h、12 h、24 h、48 h、72 h五組，每小組6只。

1.2主要試劑及材料 2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染料(美國Ameresco公司產品)。4%多聚甲醛(天津市光復精細化工研究所產品)。p-p38MAPK一抗體(Bioworld公司產品)。兔抗大鼠Fas、FasL一抗體及相應二抗(武漢博士德生物工程有限公司)。TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒(美國Roche公司產品)。栓線(北京西濃科技有限公司)。

1.3實驗儀器 電腦生物組織攤烤片機(浙江金華科迪)；自動脫水機、電腦生物組織包埋機、石蠟切片機、光學顯微鏡均為德國LEICA 公司產品，真彩病理圖文分析系統(德國 LEICA LAS4.0.0)。

1.4動物模型的制備 模型組：采用Longa等〔7〕的大腦中動脈線栓法制備大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型。缺血預處理組：大鼠用10%水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射麻醉，分離暴露右頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，結扎頸外動脈的遠端，將栓線從頸外動脈殘端迅速輕柔插入，經頸總動脈分叉部進入頸內動脈，阻斷大腦中動脈血流。10 min后從頸外動脈輕輕抽出栓線，完成預缺血。3 d后再次麻醉大鼠，步驟同模型組。假手術組：僅分離右頸總動脈。

1.5神經功能缺損評分 根據文獻〔8〕提供方法進行評分，兩位協作者在大鼠腦梗死后各觀察時間點分別雙盲進行評分取均值，評分標準：0分：無神經功能缺損癥狀；1分：輕度局灶性神經功能缺損,不能完全伸展左前肢；2分：中度神經功能缺損,向左轉圈；3分：重度神經功能缺損,向左傾倒；4分：不能自發行走，意識喪失。

1.6腦梗死體積測定 大鼠再灌注24 h后，各組隨機選取6只，處死后斷頭取腦，切除額極與枕極，沿冠狀面等分切成5片，腦片浸入2% TTC磷酸鹽緩沖液中(放入37℃水浴箱避光孵育)染色30 min，繼續4%多聚甲醛中4℃固定24 h，照相測得各層梗死面積。

1.7p-p38MAPK、Fas、FasL蛋白檢測 造模成功后在各觀察時間點處死各組大鼠，麻醉大鼠，暴露胸腹腔，灌注針從心尖部刺入直至主動脈，剪開右心耳，首先用生理鹽水心臟灌注，待沖出的液體變清亮、大鼠四肢蒼白后立即換用4%多聚甲醛灌注固定，大鼠全身抽搐僵硬后迅速斷頭取腦，切片，4%多聚甲醛4℃固定24 h。常規梯度濃度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。蠟塊切片厚度5 μm，采用免疫組織化學(SABC法，按說明操作)檢測p-38MAPK、Fas、FasL蛋白表達。

1.8細胞凋亡檢測 TUNEL法檢測神經細胞凋亡：石蠟包埋的切片常規脫蠟脫水，嚴格按照TUNEL法原位細胞凋亡檢測試劑盒說明操作。光鏡下(1×400)在梗死邊區隨機選取5個互不重疊視野，計數神經元凋亡細胞，計算凋亡指數(AI)=陽性細胞/(陽性細胞+陰性細胞)×100%。

1.9統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析及獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1神經功能缺損評分 假手術組大鼠無神經功能缺損癥狀，評分為0分；模型組大鼠反應差,體重下降，對側前肢屈曲收縮、不能完全伸展，行走時向左轉圈或、傾倒，神經功能缺損評分均>2分;缺血預處理組各時間點神經功能評分顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

2.2腦梗死體積測定 模型組大鼠腦梗死體積百分比〔(39.8±2.64)%〕較缺血預處理組明顯增大〔(22.2±2.32)%，t=12.322，P<0.05〕。

2.3大鼠腦組織 p-p38MAPK蛋白表達 p-p38MAPK蛋白免疫組化染色顯示細胞質及細胞核著色為棕黃色。與假手術組比較，模型組及缺血預處理組p-p38MAPK蛋白表達水平均明顯上調(P<0.05)；缺血預處理組較模型組表達明顯下降(P<0.05)。見表2，圖1。

表1 各組腦缺血后各時間點神經功能評分分)

表2 各組大鼠不同時間腦組織p-p38MAPK蛋白表達(%,

與假手術組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05，下表同

2.4大鼠腦組織Fas蛋白表達 Fas陽性細胞主要分布在細胞質，著色為棕黃色。與假手術組比較，模型組、缺血預處理組Fas蛋白表達水平均明顯上調(P<0.05)；缺血預處理組Fas蛋白表達明顯低于模型組(P<0.05)。見圖2，表3。

2.5大鼠腦組織 FasL蛋白表達 FasL蛋白免疫組化染色顯示細胞質著色為棕黃色。與假手術組比較，模型組、缺血預處理FasL蛋白表達水平均明顯上調(P<0.05)。缺血預處理組 FasL蛋白表達明顯低于模型組(P<0.05)。見表4，圖3。

2.6大鼠腦組織凋亡細胞TUNEL法結果 假手術組大腦皮層及海馬區偶見凋亡細胞，缺血預處理組及模型組凋亡細胞顯著增多。缺血預處理組與模型組比較凋亡細胞數明顯減少(P<0.05)。見圖4，表5。

圖1 各組腦組織p-p38MAPK蛋白表達(DAB，×400)

圖2 各組腦組織Fas蛋白表達(DAB，×400)

組別6 h12 h24 h48 h72 h假手術組7.50±1.0511.67±1.8614.171)±2.3213.00±2.379.67±2.16模型組32.33±1.371)34.67±2.161)35.67±2.161)34.33±1.751)33.50±1.381)缺血預處理組18.33±2.801)2)21.17±2.321)2)22.83±2.711)2)21.50±1.871)2)19.50±1.521)2)

表4 各組大鼠不同時間腦組織 FasL蛋白表達(%,

圖3 各組腦組織FasL蛋白表達(DAB,×400)

圖4 各組腦組織凋亡情況(TUNEL,×400)

組別6 h12 h24 h48 h72 h假手術組9.50±2.0710.33±1.6311.75±1.3714.58±1.7411.92±1.74模型組37.75±2.231)39.25±2.721)40.58±1.721)45.67±1.081)38.92±2.331)缺血預處理組20.42±1.741)2)21.58±1.911)23.25±1.131)2)28.92±1.561)2)21.58±2.461)2)

3 討 論

缺血預處理是Murry等〔9〕于1986年在犬心肌缺血模型中發現的。Kitagawa等〔10〕首次提出了缺血預處理的概念，闡明了腦缺血耐受現象，即給予輕微的短暫性非致死性腦缺血可以產生確切的腦保護效應，對此后嚴重的持續腦缺血/再灌注損傷產生耐受，起到減少腦梗死后神經元死亡、促進神經功能恢復等作用。腦缺血再灌注損傷可激活p38MAPK信號通路促進腦神經元凋亡〔11〕。p38MAPK信號通路的活化與Fas、FasL通路關系密切，在腦缺血損傷、細胞凋亡的過程中發揮重要作用〔12,13〕。抑制p38MAPK磷酸化是高壓氧預處理誘導神經保護作用的重要機制，與p38MAPK抑制劑(SB203580)誘導的神經保護作用相當〔14〕。缺血后適應可以降低心肌梗死患者血清FasL峰值、減少細胞凋亡〔15〕，提示Fas/FasL系統可能參與腦缺血耐受的機制。以往研究證實CIP可通過抑制p38MAPK磷酸化、減少p-p38MAPK表達而抑制p38MAPK通路活化，從而抑制神經元凋亡〔16～18〕。也有研究發現肢體缺血預處理對肝缺血再灌注有延遲性保護作用,抑制缺血再灌注肝組織p38MAPK的磷酸化是其重要機制之一〔19〕。本研究表明，CIP能提高腦組織對急性缺血性腦損傷的抵抗力,促進神經功能恢復，減少梗死面積，提示缺血預處理可能通過有效抑制p38MAPK磷酸化，抑制Fas、FasL通路的激活,抑制神經元凋亡,從而發揮腦保護作用，抑制p38MAPK的磷酸化及Fas、FasL信號通路的激活可能是腦缺血耐受機制之一。

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