內皮素A受體拮抗劑BQ-123對蛛網膜下腔出血大鼠學習記憶功能的影響

劉俊杰 王婧瑤 梁文吉 王一超 張婧曦 孫竹梅 趙 旭 趙雅寧 李建民

(華北理工大學，河北 唐山 063000)

自發性蛛網膜下腔出血(SAH)致殘率高、發病多見于中青年，嚴重威脅人類健康和生命。隨著臨床診療技術的提高，患者的存活率顯著提高，但存活下來的患者約20%伴有認知功能障礙〔1,2〕。自噬是指通過對蛋白質聚集體，長壽命蛋白及受損細胞器的降解和回收利用以維持內環境穩定的細胞代謝過程，其在饑餓、缺氧、內質網應激、線粒體損傷及使用一些藥物干預時均可被誘導激活，是促進細胞存活的重要機制〔3〕。課題組前期研究發現SAH在造成神經損傷的同時也會改變自噬過程，且自噬主要發生于神經細胞中〔4〕。內皮素(ET)A受體屬于7次跨膜耦聯G-蛋白受體的超家族，文獻報道，SAH后可發現ETA的高表達〔5〕。因此ETA成為可能的藥物調控靶點。ET受體(ETR)拮抗劑BQ-123是一類高特異性親和力，可與ET競爭性結合ETA受體〔6〕。本研究應用BQ-123ETA對SAH大鼠進行治療性干預，觀察大鼠學習記憶功能改變及神經細胞自噬的水平。

1 材料與方法

1.1動物及分組 144只SPF級雄性SD大鼠(體重350～400 g)，購自華阜康實驗動物有限公司〔動物許可證號SCXK(京)2016-003〕。飼養于華北理工大學醫學研究中心，適應性喂養1 w，自由進食水。所有實驗操作均經華北理工大學倫理委員會批準。采用隨機數字表法將144只大鼠分為Sham組、SAH組、BQ-123組，每組再按取材時間點不同，隨機分為6、24、72、144 h亞組(n=12)。

1.2主要試劑與儀器 多克隆Beclin-1和LC3-Ⅱ一抗(美國Santa Cruz公司)，二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)及檸檬酸鹽緩沖液(武漢博士德)，大鼠腦立體定位儀(深圳瑞沃德)，OLYMPUS攝像顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，圖像采集及分析系統(北京航空航天大學)。

1.3SAH模型制備及給藥 如文獻所述〔7〕，采用經典自體血枕大池二次注血法：采股動脈非抗凝動脈血0.3 ml，頸后正中切口，暴露環枕膜，刺破環枕膜向枕大池注射自體動脈血，48 h后重塑一次。Sham組只手術暴露，不進行環枕膜穿刺及枕大池注射，余操作均與SAH組完全一致。模型成功判定標準：①注射成功后可以觀察到大鼠呼吸、心率的加快，肌肉抽搐；②腦組織大體標本可在腦基底節區看到散在血凝塊。BQ-123組：據Paxinos-Watson腦定位圖，以前囟為零點，調節腦定位儀(AP:-0.8 mm;ML:1.5 mm;DV:3.3 mm)并標記。于標記點鉆直徑0.5 mm骨孔，微量注射器緩慢地注射BQ-123到側腦室。劑量：18 μg，5 μl。

1.4行為學檢測 各組大鼠在相應時間點分別置入穿梭箱內，實驗開始前暗適應5 min，隨后給予5 s的鈴聲刺激，再立即予以30 s電刺激，中間隔開20 s行下一次練習。試驗中大鼠受到鈴聲刺激5 s內，能夠迅速逃離危險區，則被界定為一次主動回避反應；若鈴聲刺激5 s,大鼠未逃離危險區，則再次予以30 s電刺激，如果此時大鼠逃向安全位置，計為1次被動回避反應。連續記錄30次，收錄遭受電擊時間-被動回避潛伏期(PAL)、主動回避反應次數。計算主動回避反應次數占總訓練次數的百分比即為主動回避反應率(AARR)。AARR越高，PAL越短，提示動物學習記憶能力越強，反之則越弱〔8〕。

1.5病理學檢測 各時間點取5只大鼠，提前預冷的PBS緩沖液灌注，再用4%的多聚甲醛溶液灌注固定，固定后迅速取腦，多聚甲醛溶液中固定48 h，截取視交叉平面以后至大腦橫裂以前段腦組織，冠狀切割為3份，常規脫水、透明，石蠟包埋，切片，切片厚度為4 μm，進行HE染色。400倍顯微鏡下觀察海馬CA1區神經細胞形態變化，并計數存活神經元個數。

1.6Beclin-1和LC3-Ⅱ免疫組織化學染色 切片常規脫蠟至水，檸檬酸鹽高壓熱修復，分別滴加Beclin-1多克隆抗體(濃度1∶200)、LC3-Ⅱ多克隆抗體(濃度1∶300)，4℃孵育過夜；滴加二抗，37℃溫箱孵育30 min，DAB顯色，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。PBS代替一抗陰性對照，400倍顯微鏡下觀察海馬區細胞形態變化并計數陽性細胞數量。

1.7統計學方法 應用Graphpad Prism7.0建立數據庫進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析、SNK法。

2 結 果

2.1BQ-123對SAH大鼠學習記憶功能的影響 與Sham組比較，SAH組大鼠對刺激反應遲鈍，各時間點AARR均值顯著降低，PAL時間顯著延長(P<0.05)；與SAH組比較，BQ-123組大鼠反應較為靈敏，能夠有效躲避電擊，各時間點AARR顯著升高，PAL時間顯著縮短(P<0.05)。見表1，表2。

表1 各組大鼠不同時間點AARR比較

與Sham組比較：1)P<0.05；與SAH組比較：2)P<0.05，下表同

表2 各組大鼠不同時間點PAL比較

2.2BQ-123對SAH大鼠海馬區神經細胞形態的影響 Sham組大鼠海馬區神經細胞排列規整，細胞核飽滿，近似圓形，核仁清晰。SAH組海馬區神經細胞出現深染，胞核邊界不清，核固縮、碎裂，核溶解，三角形的死亡細胞形態，其中正常形態神經細胞數量較Sham組明顯減少(P<0.05)；而BQ-123組神經細胞形態損傷程度明顯減輕，與SAH組比較，BQ-123組各時間點神經細胞數量均明顯增多(P<0.05),見圖1，表3。

圖1 各組大鼠24 h海馬CA1區神經元細胞形態變化(HE，×400)

組別6 h24 h72 h144 hSham組132.00±1.90132.50±1.37132.83±2.23132.83±2.13SAH組75.17±1.941)87.50±2.591)96.00±2.191)103.17±1.941)BQ-123組87.00±2.832)103.17±1.472)109.83±2.312)114.33±2.582)

2.3BQ-123對自噬因子的影響 Sham組大鼠海馬CA1區Beclin-1、LC3-Ⅱ為弱陽性表達，偶可見陽性細胞，陽性細胞的胞質呈棕黃色淡染；與Sham組比較，SAH組每個時間點的Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白陽性細胞數量顯著增多，且呈強陽性表達，胞質呈深棕黃色(P<0.05)；BQ-123組每個時間點Beclin-1、LC-3Ⅱ蛋白表達進一步增強，陽性細胞數量均較SAH組增多(P<0.05)，見圖2，表4，表5。

圖2 各組24 h海馬CA1區神經元細胞Beclin-1及LC3-Ⅱ的表達(DAB，×400)

組別6 h24 h72 h144 hSham組23.83±1.3324.33±1.0323.67±1.3723.50±1.05SAH組31.00±1.411)45.33±2.341)37.17±2.141)30.33±2.581)BQ-123組 42.17±1.942) 58.00±0.632) 49.50±2.172) 37.17±1.942)

表5 各組大鼠海馬區不同時間點LC3-Ⅱ表達結果個/高倍視野)

3 討 論

AARR和PAL能客觀地反映大鼠學習記憶功能。本研究結果提示，SAH后大鼠的學習記憶功能受損，而BQ-123治療后大鼠的學習記憶能力有明顯改善。BQ-123可以與ET-1結合，緩解血管痙攣、抑制交感神經系統及腎素-血管緊張素系統的活性〔9〕。文獻報道，腦缺血再灌注損傷中BQ-123在血漿中與ET競爭性結合ETAR，進而緩解血管收縮，抑制血管痙攣，改善組織灌注壓，使細胞缺血缺氧得到相應改善〔10〕，因此，BQ-123可以減少神經細胞的死亡，從而使學習記憶功能得到了改善。

本研究顯示SAH組大鼠海馬區存活神經元數目明顯下降，而BQ-123組神經細胞的損害明顯減少，BQ-123可以提高SAH后大鼠海馬區Beclin-1、LC3-Ⅱ的表達水平，增強自噬激活的程度，同時大鼠海馬區神經細胞丟失數量明顯減少。張云東等〔11〕研究發現BQ-123組可明顯緩解腦血管痙攣，改善腦部血液流量。BQ-123的干預作用，使ET-1不能同ETA有效結合，不能有效水解磷脂酰肌醇，減少了鈣離子釋放，改善腦組織的血供〔10〕。而大量的ET-1與ETB的受體結合，釋放內源性一氧化氮，緩解血管痙攣，舒張血管，緩解腦組織缺血缺氧的狀態。Ceylan-Isik等〔12〕報道，ET-1能夠降低Beclin-1表達下調，降低自噬的活性，BQ-123處理可以提高心肌細胞自噬的活性，ET-1與自噬存在密切調控關系。本研究顯示，BQ-123可能是與ET-1競爭ETA受體，緩解腦血管痙攣，改善腦組織缺血缺氧，從而改變自噬的活化狀態，減輕海馬區神經細胞丟失，從而改善大鼠的學習記憶能力。但BQ-123對自噬的調控機制及相關靶點本實驗未進行深入探討，我們將作為后續研究的方向。

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