乙醇熏蒸對雙孢蘑菇保鮮品質的影響

張洪翠，李云云，靳苗苗，張敏

(西南大學 食品科學學院，農業部農產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(重慶)， 重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶,400715)

雙孢蘑菇(Agaricusbisporus)是全球性栽培最多的食用菌[1]，味美且營養價值高，深受消費者喜愛。然而雙孢蘑菇采后易受機械損傷、失水、褐變、微生物侵染，失去商品價值[2]，常溫下貨架期只有1～3天[3]，如何延長雙孢蘑菇采后貯藏期并保持其品質是亟待解決的問題。雙孢蘑菇是由分化的菌絲組成，菌絲為輕質晶格結構[4]，交織疏松且缺少可以防止微生物侵襲和水分散失的物理結構[5]；采收后其同化作用已停止，而生命活動仍在進行，異化作用(呼吸作用)直接或間接地影響著各種生理生化過程，降低其耐貯性和抗病性[6]。研究表明，乙醇對細胞具有強滲透力，可導致微生物體細胞蛋白質永久變性，從而殺死微生物，減少果蔬營養成分消耗，延長果蔬貯藏期[7]；另外，乙醇通過抑制乙烯的生物合成，能夠有效抑制呼吸強度的升高[8]。HERPPICH等[9]用乙醇處理白蘆筍，結果表明乙醇處理能夠抑制呼吸強度、微生物和失重率的增長，維持較高的可溶性固形物和Vc含量，保持較好的白蘆筍銷售品質。另外，已有研究表明，乙醇處理具有保持果實白度和營養成分，延緩組織衰老，控制采后腐爛等作用，對楊梅[10]、草莓[11]、青花菜[12]、桃[13]、蘋果[14]等多種果蔬具有良好的保鮮效果。目前，關于乙醇熏蒸處理對雙孢蘑菇采后品質影響的研究還未見報道。因此，本文通過對雙孢蘑菇進行乙醇熏蒸處理，研究不同濃度乙醇對雙孢蘑菇保鮮品質的影響，為乙醇熏蒸處理在雙孢蘑菇保鮮中的應用提供科學依據，解決雙孢蘑菇采后的保鮮問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雙孢蘑菇，購于北碚天生農貿市場。要求同批采收，無病蟲害和機械損傷，菇體成熟度、大小、形狀、顏色均勻一致，采后8 h內運送至實驗室。

95%乙醇、牛血清蛋白、冰乙酸、無水乙酸鈉、茚三酮、正丙醇、正丁醇、乙二醇、L-亮氨酸、異丙醇、抗壞血酸、甲醇，成都市科龍化工試劑廠；NaOH、HCl、考馬斯亮藍G-250、H3PO4，重慶川東化工集團有限公司；KI、KIO3、淀粉、無水乙醇，重慶北碚化學試劑廠；平板計數瓊脂(PCA)，北京奧博星生物技術公司。

1.2 儀器與設備

Pac Check?Model 650EC頂空分析儀，美國MOCON公司；HWS低溫恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司；H1650R臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀公司；UltraScan?PRO測色儀，美國HunterLab公司；UV-2450PC紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.3 樣品處理

挑選大小一致，無開傘，無病害，無機械損傷的雙孢蘑菇進行處理。將雙孢蘑菇隨機分為4組，每組雙孢蘑菇800 g左右，放入泡沫箱內，同時放入展開的4層紗布(遠離雙孢蘑菇)，分別取一定量的乙醇(體積分數95%)均勻滴在紗布上，立即密封，室溫(25 ℃)熏蒸處理3 h。試驗中乙醇熏蒸濃度分別為0(CK)、200、400、600 μL/L(乙醇溶液體積與泡沫箱體積比)，處理結束后，將雙孢蘑菇通風30 min后放入(3±1)℃的冷藏柜預冷30 min，最后分裝到PE塑料袋(厚度為40 μm)內封口，每袋(100 ±5)g，每組有3個平行。將包裝后的雙孢蘑菇放于(3±1)℃的冷藏柜中貯藏12 d，每2 d測定1次指標。

1.4 測定指標與方法

1.4.1 呼吸強度

呼吸強度采用靜置法經頂空分析儀進行測定[15]。用頂空氣體分析儀檢測大氣中的CO2含量，記為ψ0，隨機選取雙孢蘑菇80 g，放入干燥皿中密封，25 ℃下靜置30 min，檢測干燥皿中CO2含量，記為ψ1。呼吸強度以每小時每千克雙孢蘑菇在呼吸代謝過程中釋放的CO2的質量表示。計算公式如下：

(1)

式中：ψ0，大氣中CO2體積分數，%；ψ1，干燥皿中CO2體積分數，%；V，干燥皿中密閉空間的體積，mL；m，雙孢蘑菇質量，kg；t，測定時間，h；1.96，CO2的摩爾質量/摩爾體積之比(=44/22.4；按標準狀況下計算)。

1.4.2 失重率

采用稱重法測定，按公式(2)計算：

(2)

1.4.3 白度值

參考JAWORSKA等[16]方法進行測定。

1.4.4 硬度值

參考JIANG等[17]方法進行測定。用美國CT-3型質構儀測定，探頭直徑為5 mm，將雙孢蘑菇去柄，切掉菌蓋上2 mm厚的表皮，將切好的雙孢蘑菇固定在操作臺上，保持切面與探頭接觸面平行，探頭以2 mm/s的穿刺速率進行下壓，下壓深度為6 mm，得到力與時間的作用曲線，最大峰值(Nmax)即為硬度值。

1.4.5 可溶性固形物

參考曹健康等[18]方法進行測定。采用UV-2450便攜式手持折光儀測定。

1.4.6 Vc含量

采用碘酸鉀滴定法[18]進行測定。

1.4.7 游離氨基酸

采用茚三酮顯色法[18]進行測定。

1.4.8 微生物

參照GB/T 4789.2—2010《食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定》[19]進行測定。

1.4.9 感官評價

參考石啟龍等[20- 21]方法。由經過培訓的6人對雙孢蘑菇的色澤、質地、異味等感官指標進行評定。感官指標評定標準如表1所示。

表1 雙孢蘑菇感官指標評價標準Table 1 Sensory evaluation criteria of Agaricus bisporus

1.5 數據處理

采用Microsoft Excel 2010 進行數據整理，用SPSS 13.0進行統計分析，使用最低顯著性差異法(LSD)進行顯著性差異檢驗，顯著性水平為 0.05，Origin 2016進行圖像處理。

2 結果與分析

2.1 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇呼吸強度的影響

呼吸強度是衡量果蔬組織新陳代謝的一個重要指標，雙孢蘑菇屬于呼吸躍變型園藝產品，采后子實體呼吸作用旺盛，會消耗蘑菇體內關鍵營養成分，降低其食用品質和貯藏性，所產生的呼吸熱也會影響其貯運[22]。如圖1所示，貯藏期間各組雙孢蘑菇的呼吸強度呈先上升后下降的趨勢。各組雙孢蘑菇在貯藏第2天都達到呼吸高峰，與對照組相比，處理組都極顯著地降低了呼吸峰值(p<0.01)，其中400 μL/L組為70.66 mg/(kg·h)，將呼吸峰值降低了20.53%；600 μL/L組貯藏前、中期與對照組差異顯著(p<0.05)，從第10天起無顯著差異(p>0.05)，可能是因為乙醇濃度過高，導致乙醇過量滲入細胞，使胞內蛋白變性，對細胞產生毒害，使雙孢蘑菇后期抵抗力變弱，微生物大量繁殖導致腐敗，致使呼吸強度升高。由此可見，適當濃度乙醇熏蒸處理能顯著抑制貯藏期間雙孢蘑菇的呼吸強度，尤其是400 μL/L處理組，與對照組在整個貯藏期間都存在極顯著差異(p<0.01)。這與WEBER等[23]用0.3 mL/kg的乙醇熏蒸處理蘋果所得結果一致。ASODA等[24]用乙醇熏蒸處理西蘭花也得出相似的結論。

圖1 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇呼吸強度的影響Fig.1 Effects of ethanol fumigation on respiration rate of Agaricus bisporus

2.2 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇失重率的影響

水分含量是衡量雙孢蘑菇新鮮程度的重要指標之一[25]。雙孢蘑菇貯藏期間的失重主要是由于失水造成的，一方面細胞組織喪失的水分，導致包裝袋內積水，易孳生致病微生物；另一方面采后蒸騰作用是不可逆的，散失的水分無法得到補償，菇體會萎蔫、褐變，嚴重影響雙孢蘑菇的感官品質[26]。如圖2所示，各組雙孢蘑菇的失重率均隨貯藏時間的推移持續升高，但貯藏前期上升急促，這可能與雙孢蘑菇表皮結構薄弱，無法阻止表面快速脫水有關；還可能與前期雙孢蘑菇呼吸強度(圖1)和蒸騰作用較高有關。貯藏0～4 d，200 μL/L處理組與對照組一直存在顯著性差異(p<0.05)；貯藏至第6 d，400 μL/L處理組與對照組開始有極顯著差異(p<0.01)。貯藏12 d，各組失重率分別達到6.66%、4.57%、3.51%、5.32%，組與組之間差異顯著(p<0.05)，其中400 μL/L處理組比對照組失重率降低了47.3%。由此可知，適當濃度的乙醇熏蒸處理雙孢蘑菇能夠顯著抑制失重率的上升。這可能是由于乙醇作為脂肪醇溶解在膜脂雙層中，使細胞膜穩定性和疏水性增強[27]；也可能是由于乙醇使細胞保持較高的滲透壓[28]，阻礙水分向細胞壁和細胞間隙滲透，從而降低失重[29]。

圖2 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇失重率的影響Fig.2 Effects of ethanol fumigation on weight loss of Agaricus bisporus

2.3 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇白度的影響

白度值是判斷蘑菇貯藏期間色澤變化的重要指標，也直接影響其商品性。如圖3所示，隨著貯藏時間的延長各組雙孢蘑菇的白度值不斷降低，且后期下降急促。在整個貯藏期間，200 μL/L組、400 μL/L組與對照組均存在顯著性差異(p<0.05)；第10天后，600 μL/L組與對照組也產生顯著差異(p<0.05)。到貯藏期結束時，處理組使白度值分別維持在80.48、81.55、78.48，而對照組只有76.85，處理組與對照組差異顯著(p<0.05)。劉洪麗[30]用乙醇處理鮮切萵苣和荸薺，降低了褐變多酚底物的濃度，從而減少色素類物質的生成，有效減緩了鮮切萵苣和荸薺的褐變進程。HU等[27]研究表明，乙醇處理能抑制褐變，是由于外源乙醇處理能夠抑制活性氧和氧化類酶的活性。

圖3 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇白度的影響Fig.3 Effects of ethanol fumigation on whiteness of Agaricus bisporus

2.4 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇硬度的影響

果蔬的硬度能夠直接反應果蔬的貯藏效果，在貯藏期間果膠、多糖等大分子物質降解導致硬度下降。如圖4所示，在貯藏期間各組雙孢蘑菇的硬度呈波動性下降趨勢。貯藏前期，硬度下降速率快，可能是由于前期失重和呼吸強度高造成的。第4天，各組硬度分別由開始的49.97 N下降至40.42、38.38、43.92、42.5 N，其中400 μL/L組與對照組存在顯著差異(p<0.05)。貯藏末期，相比處理組，對照組硬度下降速率快，可能與后期對照組微生物增加，加速了雙孢蘑菇的腐敗變軟有關。第12天，處理組硬度分別達到36.18、38.78、36.89 N，對照組達到32.07 N，處理組硬度明顯高于對照組，200 μL/L組與對照組存在顯著差異(p<0.05)，其中400、600 μL/L組與對照組存在極顯著差異(p<0.01)。表明乙醇熏蒸能有效維持雙孢蘑菇的硬度，以400 μL/L組效果最為顯著。乙醇能夠抑制果實的軟化，可能與其抑制細胞壁降解有關[28]。

圖4 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇硬度的影響Fig.4 Effects of ethanol fumigation on firmness of Agaricus bisporus

2.5 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇總酚含量的影響

酚類物質的存在是果蔬酶促褐變發生的必要條件，與果蔬的品質、風味形成等密切相關。采后的菇體中含有大量的酚類物質，與氧氣接觸后被氧化為赤褐色的醌和水，最終氧化聚合成黑褐色物質[31]。如圖5所示，在整個貯藏期間雙孢蘑菇總酚含量呈先升高后下降趨勢。貯藏第2天，總酚含量達到峰值，可能是因為貯藏前的切根處理的外界脅迫，加快了苯基丙酸類合成途徑，產生了更多的酚類物質來抵抗外界的傷害[32]，其中400 μL/L、600 μL/L組總酚含量顯著低于對照組(p<0.05)；到貯藏末期，與對照組相比，處理組顯著抑制了總酚的產生(p<0.05)。總體而言，乙醇熏蒸能一定程度上降低總酚含量，特別是400 μL/L組整體效果最好，可能與乙醇熏蒸處理抑制總酚的合成，從而降低貯藏過程中的總酚含量有關。YAN等[33]研究表明外源乙醇能抑制苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的表達，從而抑制PAL酶的合成，進而抑制酶促褐變底物酚類物質的合成，抑制酶促褐變。

圖5 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇總酚含量的影響Fig.5 Effects of ethanol fumigation on total phenol content of Agaricus bisporus

2.6 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇Vc含量的影響

Vc是人類營養中最重要的維生素之一，是果蔬重要的營養指標。如圖6所示，在整個貯藏期間雙孢蘑菇抗壞血酸含量整體呈下降趨勢。貯藏第2天，處理組與對照組之間差異顯著(p<0.05)，其中200、400 μL/L組與對照組在整個貯藏期間均存在極顯著差異(p<0.01)；到貯藏結束時，200、400 μL/L組抗壞血酸含量分別維持在1.64 mg/100g、1.91 mg/100g，而對照組已降至1.24 mg/100g。由此表明，乙醇熏蒸能有效緩解雙孢蘑菇Vc含量的下降。這可能是由于乙醇蒸氣對雙孢蘑菇代謝活性的抑制作用，使最初形成的抗壞血酸在貯藏期間沒有得到利用[34]。馬瑜等[35]用乙醇熏蒸處理草莓，結果表明，適量濃度的乙醇能維持較高的抗壞血酸含量。乙醇處理葡萄[36]、藍莓[37]等的研究也得出相似結論。

圖6 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇Vc含量的影響Fig.6 Effects of ethanol fumigation on Vc content of Agaricus bisporus

2.7 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇可溶性蛋白質含量的影響

可溶性蛋白質參與果蔬多種生理生化代謝過程的調控，是果蔬品質和營養的重要指標之一。如圖7所示，隨著貯藏時間的延長，各組雙孢蘑菇可溶性蛋白質含量整體呈波動性下降趨勢。1～4 d可溶性蛋白質含量下降急促，可能是由于雙孢蘑菇采收后營養供應被切斷，且剛采摘后生理代謝旺盛，消耗了大量的可溶性蛋白質。第4天，處理組可溶性蛋白質含量分別降至2.46、2.67、2.53 mg/g，對照組降至2.04 mg/g，處理組與對照組差異顯著(p<0.05)，3個處理組之間不存在顯著差異(p>0.05)。第6天，CK組可溶性蛋白質含量有上升的趨勢，可能與CK組失水率增加，降低可溶性蛋白質水解有關。第12天，400 μL/L組可溶性蛋白質含量為2.44 mg/g，而對照組已降至1.95 mg/g，兩組差異極顯著(p<0.01)，200 μL/L與600 μL/L組分別為2.2 mg/g和2.17 mg/g，與對照組差異顯著(p<0.05)。由此可見，乙醇熏蒸處理雙孢蘑菇能顯著抑制可溶性蛋白質含量的下降，其中400 μL/L組效果最明顯。陶煒煜[38]用不同濃度的乙醇熏蒸處理鮮切西蘭花，結果表明6 kg/mL的乙醇熏蒸處理在抑制可溶性蛋白質降低方面效果最好。

圖7 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇可溶性蛋白質含量的影響Fig.7 Effects of ethanol fumigation on soluble protein content of Agaricus bisporus

2.8 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇微生物的影響

子實體是由菌絲扭結形成的結構，菌絲纖細，無角質層的保護，極易遭致微生物的侵染[39]。乙醇熏蒸對雙孢蘑菇菌落總數的影響如圖8所示，第0天，乙醇熏蒸結束后立刻測各組微生物含量，分別由對照組的6.7 lg(CFU/g)降至200 μL/L組的5.87 lg(CFU/g)，400 μL/L組的5.69 lg(CFU/g)，600 μL/L組的5.47 lg(CFU/g)，說明與對照組相比乙醇處理能夠明顯殺滅部分微生物(p<0.01)，且在一定范圍內，濃度越大效果越好，處理組之間存在顯著差異(p<0.05)。第2天，對照組微生物含量相對初始值降低，可能是因為雙孢蘑菇于PE包裝袋內貯藏，氧氣含量減少，抑制了部分好氧菌的繁殖。隨著貯藏時間的延長，各組微生物都在增加，600 μL/L組后期微生物繁殖較快，可能是由于乙醇濃度過高，短時間內使微生物體表蛋白質變性，表面蛋白凝固形成保護層，致使后期存活的微生物大量繁殖[33, 40-41]。HERPPICH等[9]也認為，適量濃度的乙醇處理能抑制貯藏期間白蘆筍微生物的生長，但并不是乙醇濃度越高越好。第12天，對照組微生物含量高達8.32 lg(CFU/g)，處理組分別為7.49 lg(CFU/g)、7.24 lg(CFU/g)、7.75 lg(CFU/g)，3個處理組與對照組均存在極顯著差異(p<0.01)。整體而言，乙醇熏蒸處理能夠極顯著殺滅、抑制微生物的生長(p<0.01)，3個處理組中，400 μL/L組效果最佳。乙醇能夠有效抑制菌落總數的增長，可能與乙醇使菌體蛋白脫水變性，且降低菌體表面張力，改變細胞膜滲透性及原生質結構的作用有關[42]。馮曉汀等[43]用乙醇熏蒸處理鮮切西蘭花也得出類似結論。已有研究表明，乙醇處理可顯著控制灰霉、輪帚霉、桔青霉、綠色木霉等病菌孢子的萌發[44]。

圖8 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇菌落總數的影響Fig.8 Effects of ethanol fumigation on total bacterial counts of Agaricus bisporus

2.9 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇感官評價的影響

乙醇熏蒸對雙孢蘑菇感官評價的影響如圖9所示，雙孢蘑菇感官評分隨著貯藏時間的延長而降低，但后期下降速度相對較快，并且異味、發黏、褐變嚴重，可能與后期微生物(圖8)繁殖較快有關。第6天，對照組開始出現稍軟、發黏、異味現象，而乙醇處理組均保持較好的品質。第8天，對照組褐變嚴重并伴有開傘現象，而此時乙醇處理組仍沒有發黏、異味現象，可能與乙醇處理能有效抑制微生物(圖8)繁殖有關。第10天開始，對照組已出現嚴重異味、發黏、褐變現象，此時感官評價得分為5.15分，已失去商品價值，而乙醇處理組仍保持在6分以上，具有一定的商品價值。第12天，400 μL/L組的感官評價得分為6.55分，仍具有一定的商品性，但其他3組都已失去商品價值。可見，乙醇熏蒸處理可以有效地保持雙孢蘑菇的感官評分。

圖9 乙醇熏蒸對雙孢蘑菇感官評價的影響Fig.9 Effects of ethanol fumigation on sensory properties of Agaricus bisporus

3 結論與討論

本試驗研究了不同質量濃度(200、400、600 μL/L)的乙醇熏蒸對雙孢蘑菇保鮮品質的影響。試驗結果表明，采用適當濃度的乙醇熏蒸處理雙孢蘑菇能夠顯著抑制菌落總數的上升，同時有效降低了雙孢蘑菇的總酚含量，從而抑制了酶促褐變。在整個貯藏期間，乙醇熏蒸處理能顯著抑制呼吸強度和失重率的上升，有效延緩可溶性蛋白質含量的損耗，減少Vc含量的下降，且能保持較高的白度、硬度和感官評價。整體而言，400 μL/L處理組綜合保鮮效果最好，能夠有效延長雙孢蘑菇的貯藏期，且未對其感官品質產生不良影響。

由于雙孢蘑菇長期生活在陰暗潮濕的環境中，其演變而成的防御機制薄弱，采后呼吸作用成為新陳代謝的主導因素，耐貯性和抗病性降低，鮮度下降快。采后生理變化和微生物的生長繁殖是導致雙孢蘑菇子實體腐敗變質的主要原因。乙醇作為脂肪醇能溶解在膜脂雙層中，增強細胞膜的穩定性和疏水性，有效減緩果蔬的水分散失；另外，乙醇對細胞的滲透力強，可使菌體蛋白永久變性，從而抑制微生物的生長[41]。本研究表明，乙醇熏蒸處理能夠顯著抑制微生物的繁殖，400 μL/L處理組在整個貯藏期間效果最佳。這與乙醇處理能抑制鮮切山藥[45]、鮮切西蘭花[43]、鮮切芒果[46]、楊梅[47]等菌落總數的增長的研究結果相似。乙醇處理還能有效減緩細胞壁的降解進而維持果蔬硬度[37,46,48-49]，降低果蔬營養物質的消耗，保持果蔬特有的香氣。楊愛萍等[47]用 100、250、500和1 000 μL/L乙醇熏蒸處理楊梅果實3h，結果表明500 μL/L乙醇處理可以有效保持果實的營養品質，乙醇用量過高，則會引起果實的滲透傷害。徐莉等[48]在鮮切菊芋上采用150、300、450 μL/L乙醇熏蒸5 h，發現450 μL/L處理組抑制褐變效果最好。CHERVIN等[50]報道當乙醇處理濃度小于5 mL/kg時，可有效控制葡萄的采后腐爛，而較高的劑量可能誘導果實褐變[51]，并增加果實組織中的滲透脅迫。綜上可知，乙醇蒸氣的有效性受乙醇濃度的影響。由于處理對象不同，乙醇處理的最佳濃度也有所差異。本研究發現，雙孢蘑菇的保鮮效果與乙醇處理濃度密切相關，在一定濃度范圍內，乙醇濃度越高，對雙孢蘑菇的保鮮作用越大。若乙醇濃度過高，可加快微生物體蛋白質變性的速度，表面蛋白凝固形成保護層，阻斷了乙醇進入菌群、菌體內部，導致貯藏后期抑菌能力減弱；另一方面，高濃度乙醇可能對細胞產生毒害，降低雙孢蘑菇抵抗力[52]。這可能是本研究中600 μL/L處理組的保鮮效果不及400 μL/L處理組的原因。

乙醇熏蒸處理是延長雙孢蘑菇采后保鮮期安全簡便且經濟有效的方法，對雙孢蘑菇保鮮具有一定的應用價值。然而，乙醇如何影響雙孢蘑菇的采后生理，在理論上還缺乏深入的認識，其作用機理有待進一步探究。