sEH抑制劑改善ISO誘導的心肌肥厚的機制研究

張煥基 陳怡錫 吳奮生 閔敏 陳子奇 袁朝漢 伍貴富

心肌肥厚是心力衰竭和心臟性猝死的重要病理性因素。盡管臨床廣泛使用的腎素-血管緊張素-醛固酮系統抑制劑、β受體抑制劑可在一定程度上逆轉心肌肥厚，但目前由心肌肥厚導致的心力衰竭發病率和病死率仍然居高不下，因此新藥物的研發有望為心肌肥厚的治療提供新思路[1]。我們的前期研究顯示花生四烯酸的代謝產物環氧二十碳三烯酸(EET)具有改善心肌肥厚的作用，但其機制目前尚未完全清楚[2]。心肌細胞凋亡在心肌肥厚的進展中發揮著重要的作用，那么EET能否通過抑制心肌細胞凋亡進而抑制心肌肥厚，目前仍未明確。在本研究中，筆者擬通過使用可溶性表氧化物水解酶(sEH)抑制劑提升體內EET水平進而探討其改善心肌肥厚的機制。

材料與方法

一、實驗動物

SPF級雄性 SD大鼠18只，6周齡，180～200 g，由中山大學動物實驗中心提供。H9C2心肌細胞系購自美國菌種保藏中心(ATCC)。藥品與試劑：鹽酸異丙腎上腺素(ISO)注射針劑(大連美侖生物技術有限公司)，sEH抑制劑TUPs由中山大學孫逸仙紀念醫院黃輝課題組惠贈。Caspase 3抗體(Abcam)，兔源性二抗(Santa Cruz)。原位缺口末端標記法(TUNEL)試劑盒(Promega，Madison，USA)。

二、方 法

1.實驗動物模型建立和分組

采用隨機數字表法將雄性SD大鼠分為3組各6只，分別為對照組(control組)、模型組(ISO組)、sEH抑制劑干預組(ISO+TUPs組)。ISO組大鼠皮下注射ISO 1 mg/(kg·d)連續14 d以建立心肌肥厚模型。ISO+TUPs組每日加予口服sEH抑制劑TUPs 0.65 mg/(kg·d)，連續14 d 。本研究遵循實驗動物倫理相關規定。

2.心臟與體質量比值測定

末次給藥后禁食12 h，稱體質量后安樂處死大鼠，取出心臟稱其質量。心臟與體質量比值=心臟質量(mg)/體質量(g)。

3.實時熒光定量PCR

按照Trizol RNA plus說明書提取組織總RNA，使用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(TaKaRa公司)進行逆轉錄合成cDNA，并用SYBR GreenⅡ，按兩步法(95 ℃、60 ℃)進行擴增及檢測，每次3個復孔，總RNA每孔500 μg。心肌細胞肥大指標心房利鈉肽(ANP)引物為：GGAGCCTGCGAAGGTCAA；TATCTTCGGTACCGGAAGCTGT；β-actin引物為：CAGATCATGTTTGAGACCTTCAA；GTGGTA-CGACCAGAGGCATACA。

4.心肌組織凋亡檢測

采用TUNEL按照試劑盒說明書操作，用二甲苯浸洗2次，每次5 min；用梯度乙醇(100%、95%、90%、80%、70%)各浸洗1次，每次3 min；用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次；用Proteinase K工作液處理組織20 min， 用PBS漂洗3次，各5 min；加50 μl TUNEL反應混合液于標本上，于37 ℃下加封口膜在暗濕盒中反應60 min。用PBS漂洗3次，各5 min。于含辣根過氧化物酶的抗熒光素抗體37 ℃濕盒中避光30 min，用PBS漂洗3次，各5 min，用3，3-二氨基聯苯胺(DAB)顯色5～10 min，用PBS漂洗3次，各5 min，用蘇木素復染細胞核數秒，流水沖洗，脫水，透明，中性樹膠封片。心肌細胞凋亡率=凋亡心肌細胞/心肌細胞總數×100%。

5.免疫組織化學檢查(免疫組化)

將心肌組織的石蠟切片脫蠟至水，加入3% H2O2室溫孵育10 min，用蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min 2次，用10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，棄去血清，滴加Caspase 3一抗(Abcam 1∶50)工作液，于37 ℃孵育 1 h。用PBS 沖洗3次各5 min，滴加生物素標記兔源性二抗(Santa Cruz 1∶100)工作液，于37 ℃孵育20 min。用PBS沖洗3次各5 min，滴加適量的辣根酶工作液，于 37 ℃孵育20 min。用PBS沖洗3次各5 min，用DAB顯色劑顯色5 min，用自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。

三、統計學處理

結 果

一、sEH抑制劑TUPs對ISO所致心肌肥厚的影響

14 d后3組間心臟質量比較差異有統計學意義(F=10.557，P=0.004)。其中，ISO 組心臟質量與體積均較control組重/大，而這一作用可以被sEH抑制劑TUPs所抑制。同時，ISO也增加心臟與體質量比值(ISO組vs. control組為8.650±0.768vs. 5.775±1.024，P=0.004)，而TUPs可減低心臟與體質量比值(ISO+TUPs組vs. ISO組為6.475±0.957vs. 8.650±0.768，P=0.012)，見圖1A、B。3組間ANP表達不全相同(F=113.375，P<0.001)，其中ISO增加ANP的表達(ISO組vs. control組為2.152±0.154vs.1.037±0.039，P<0.001)，而TUPs可以降低ISO誘導的ANP的表達(ISO+TUPs組vs. ISO組為1.470± 0.909vs. 2.152±0.154，P=0.006)，見圖1C。

圖1 control、ISO、ISO+TUPs組心臟大體形態、心臟與體質量比值、ANP表達

二、sEH抑制劑TUPs對心肌肥厚過程中心肌細胞凋亡的影響

TUNEL染色結果提示3組間心肌細胞的凋亡率有差異(F=133.533，P<0.001)。ISO 增加了心肌細胞的凋亡率[ISO組vs. control組為(1.258±0.059)%vs. (0.431±0.098)%，P=0.019)]，而TUPs可以減少ISO所致的心肌細胞凋亡率[ISO+TUPs組vs. ISO組為(0.710±0.052) %vs.(1.258±0.059)%，P=0.018]，見圖2。另外，3組Caspase 3的表達比較差異有統計學意義(F=44.675，P<0.001)，ISO增加了Caspase 3的表達(ISO組vs. control組為1.837±0.187vs. 0.999±0.084，P=0.004)，而TUPs抑制了ISO誘導的Caspase 3的表達(ISO+TUPs組vs. ISO組為1.397 ±0.071vs. 1.837±0.187，P=0.033)，見圖3。

討 論

我們的在體實驗證明了sEH抑制劑TUPs能顯著改善ISO所致的心肌肥厚，這一效應可能與TUPs抑制ISO所致的心肌細胞凋亡有關。心肌肥厚是心臟為適應各種刺激如壓力增大、容量超負荷、神經內分泌因子過渡激活等產生的病理改變，表現為心肌細胞肥大、外基質重建等。早期改變是機體發生的適應性改變，但到晚期，心臟發生失代償，最終可以引發心力衰竭、心臟性猝死等嚴重的心血管事件。盡管心肌肥厚的問題已被臨床廣泛關注，但目前仍沒有很有效的藥物可逆轉心肌肥厚。EET是新近發現的具有多種生物活性的花生四烯酸代謝產物[3]。sEH是EET分解代謝的主要代謝酶之一，通過抑制sEH可以提升EET水平，進而發揮一系列心血管保護作用。有研究顯示，在自發高血壓心力衰竭大鼠和慢性心力衰竭患者中，其心臟局部14,15-環氧化二十碳(14,15-DHET)、sEH蛋白水平和基因水平表達下降，同時該研究顯示編碼sEH的基因EPHX2是心力衰竭易感基因[4]。在AngⅡ誘導的心肌肥厚模型中，Ai等[5]證明AngⅡ可以增加sEH蛋白的表達，應用sEH抑制劑可以改善AngⅡ所造成的心肌肥厚。

圖2 control、ISO、ISO+TUPs組心肌細胞凋亡水平

圖3 control、ISO、ISO+TUPs組凋亡蛋白Caspase 3表達情況(×100)

細胞凋亡是由細胞內外各種因素觸發細胞內預存的死亡程序而引起細胞死亡的一種方式。在正常的心肌組織中，心肌細胞的凋亡率非常低，但既往研究均證實心肌肥厚的過程中心肌細胞凋亡率會以幾個數量級增加[3]。在本研究中，我們也發現在ISO所致的心肌肥厚的過程中，凋亡心肌細胞數量增加，同時凋亡蛋白Caspase 3表達也增加，但這些作用可以被sEH抑制劑TUPs抑制，故提示EET可以通過抑制心肌細胞凋亡進而改善心肌肥厚。但EET是如何抑制凋亡的仍需作進一步探討。有研究證實在缺氧和復氧的情況下，EET可以降低心肌Caspase 3的活性從而保護心臟[6]。而這一保護作用依賴于PI3K信號通路的激活。同樣Dhanasekaran等[7]也證明EET抗凋亡作用可能是通過影響PI3K下游的效應分子，例如Akt，Bcl-xl/Bcl-2相關死亡啟動子BAD和凋亡蛋白Caspase 9和Caspase 3而實現的。

綜上所述，本研究結果提示了sEH抑制劑TUPs可以通過抑制ISO所致心肌細胞的凋亡進而改善心肌肥厚，本研究結果可為心肌肥厚的治療提供新的思路。