原子力顯微鏡研究L-半胱氨酸對(duì)鰱肌球蛋白溶液熱聚集行為的影響

王艷敏，于加美，石 彤，袁 麗，高瑞昌*

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

肌球蛋白是重要的功能性蛋白質(zhì)，約占肌原纖維蛋白的55%～60%，占總蛋白的30%左右[1]。諸多研究發(fā)現(xiàn)，肌肉組織的凝膠性、持水性和乳化性等均與肌球蛋白結(jié)構(gòu)存在密切的聯(lián)系[2]。肌球蛋白是一種長(zhǎng)形不對(duì)稱小分子，包含兩條長(zhǎng)鏈構(gòu)成的桿狀尾部和兩條短鏈構(gòu)成的球狀頭部，且為鹽溶性蛋白[3]，在體外高鹽條件下（0.6 mol/L KCl）蛋白分子主要以單體或可溶性寡聚體的形式存在[4-5]，在低鹽條件下由于肌球蛋白纖絲自發(fā)聚集因而表現(xiàn)出低的溶解度[6-9]，對(duì)于鹽溶性蛋白合適的鹽濃度有利于形成理想的凝膠，但是過量的鹽則會(huì)誘發(fā)心血管和高血壓等疾病[10-12]，因此，降低鹽濃度的同時(shí)提高肌球蛋白溶解度的研究很有必要。

賴氨酸、組氨酸、精氨酸能提高低鹽條件下肌球蛋白的溶解度[13-16]，但同時(shí)肌球蛋白的熱聚集行為也發(fā)生了較大變化。Shiraki等[17]報(bào)道賴氨酸、精氨酸、甘氨酸等氨基酸能夠阻止蛋白質(zhì)的聚集，且相應(yīng)帶電側(cè)鏈起主要作用，親水性的氨基酸比疏水性氨基酸作用更明顯。然而報(bào)道多從蛋白溶解度和構(gòu)象研究氨基酸對(duì)蛋白的影響，利用更加直觀的手段研究氨基酸對(duì)蛋白聚集行為的影響鮮見報(bào)道。目前已有學(xué)者利用原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）技術(shù)研究了蛋白溶液聚集狀態(tài)[18-20]。利用該技術(shù)比較添加氨基酸前后肌球蛋白溶液聚集行為形貌的變化，可從微觀角度直觀反映半胱氨酸對(duì)肌球蛋白聚集行為的影響。AFM的應(yīng)用日益廣泛，其在蛋白質(zhì)、核糖核酸、脫氧核糖核酸、核酸與蛋白質(zhì)復(fù)合物、病毒、細(xì)胞等生物大分子上的應(yīng)用也一直吸引著生物學(xué)家的目光[21-24]。AFM利用納米級(jí)尺寸及pN級(jí)力靈敏度的探針在樣品表面進(jìn)行逐級(jí)光柵掃描得到樣品表面的形貌[25]?；诂F(xiàn)有研究，利用AFM觀察蛋白質(zhì)聚集過程中的微觀形態(tài)的變化可行且更加直觀，彌補(bǔ)了現(xiàn)有研究手段的不足。L-半胱氨酸（L-Cys）是一種親水性氨基酸，也是一種還原劑，能夠通過改變蛋白質(zhì)分子之間和內(nèi)部的二硫鍵減弱蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)伸展開。周愛梅等[26]曾報(bào)道L-Cys可顯著提高鳙魚魚糜的凝膠能力，對(duì)顏色和白度不會(huì)產(chǎn)生不利影響，是鳙魚魚糜的良好品質(zhì)改良劑。本實(shí)驗(yàn)研究L-Cys對(duì)鰱肌球蛋白熱聚集行為的影響，利用AFM觀測(cè)L-Cys存在條件下鰱肌球蛋白熱聚集行為形貌的變化，并改變離子強(qiáng)度來觀察肌球蛋白的聚集狀態(tài)及溶解度的變化，從而在降低淡水魚凝膠制品鹽添加量的同時(shí)提高肌球蛋白的溶解度，為生產(chǎn)低鹽淡水魚產(chǎn)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的花鰱魚在鎮(zhèn)江市學(xué)府路歐尚超市購(gòu)得，用碎冰塊保持低溫30 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，取鰱魚背部白肉、去骨、清洗，切成肉糜狀備用。

三（羥甲基）氨基甲烷（trihydroxymethyl aminomethane，Tris）、L-Cys（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；8-苯胺基萘-1-磺酸鹽（N-phenyl-8-naphthylamine-1-sulfonic acid，ANS）（化學(xué)純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

試劑A：0.1 mol/L氯化鉀、20 mmol/L Tris，鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.5。試劑B：0.45 mol/L氯化鉀、0.2 mol/L乙酸鎂、1 mmol/L乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸、20 mmol/L Tris、5 mmol/L β-巰基乙醇，馬來酸調(diào)節(jié)pH值至6.8。試劑C：0.5 mol/L氯化鉀、20 mmol/L Tris、5 mmol/L β-巰基乙醇，鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.5。8 mmol/L ANS-磷酸緩沖液：將ANS溶解于0.1 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖液中。

1.2 儀器與設(shè)備

Multimode 8 AFM 美國(guó)布魯克公司；Avanti J-26XP超高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；TGL-16gR飛鴿牌系列離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；IKA T18 分散儀 德國(guó)IKA 公司；UV1600紫外-可見分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器；Cary Eclipse熒光分光光度計(jì) 美國(guó)Varian公司；FE 20 pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同離子強(qiáng)度肌球蛋白溶液的制備

參考Jia Dan等[27]的方法并稍作修改。取新鮮花鰱魚背部肉糜，加入10 倍體積試劑A，利用均質(zhì)機(jī)在11 000 r/min條件下均質(zhì)6 min，每隔10 s暫停10 s。置于4 ℃反應(yīng)15 min，離心（3 000×g、6 min、4 ℃），取沉淀物量體積，加入5 倍體積試劑B，同時(shí)加入腺苷-5’-三磷酸二鈉鹽水合物，使其終濃度為10 mmol/L的懸浮液，置于4 ℃冰箱靜置90 min，離心（11 000×g，13 min，4 ℃），量取上清液，加入5 倍體積的1 mmol/L碳酸氫鉀溶液，4 ℃條件下放置20 min，離心（11 000×g、13 min、4 ℃），量取沉淀物，加入2.5 倍體積試劑C，4 ℃反應(yīng)10 min，往懸浮液中加入5 倍體積的1 mmol/L碳酸氫鉀溶液，并加入氯化鎂，使混合液終濃度為10 mmol/L，置于4 ℃冰箱過夜。離心（11 000×g、25 min、4 ℃），量取沉淀，得到肌球蛋白顆粒。得到的肌球蛋白顆粒，分別溶解在0.5 mol/L和0.1 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液中，離心（5 000×g，10 min，4 ℃），取上清液，得到不同離子強(qiáng)度條件下的肌球蛋白溶液備用。分別用雙縮脲法[28]檢測(cè)上清液中蛋白含量，并進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用Gel-Pro analyzer軟件采用光密度法，對(duì)肌球蛋白的純度進(jìn)行定量分析，肌球蛋白的純度超過90%，與Liu Ru等[29]的結(jié)果一致，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

1.3.2 L-Cys對(duì)肌球蛋白溶液溶解度的影響

肌球蛋白溶液的終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL[16]，加入L-Cys溶液（pH 7.0）使其終濃度為5 mmol/L[13-14]，混勻。將樣品分別進(jìn)行一段式加熱（90 ℃、30 min）、二段式加熱（40 ℃、60 min+90 ℃、30 min）處理[30]，以不加熱作為對(duì)照組。參考Guo等[13]的方法，用高速冷凍離心機(jī)4 ℃、5 000 r/min離心10 min，分離后取上清液測(cè)蛋白濃度，溶解度按下式計(jì)算：

1.3.3 L-Cys對(duì)肌球蛋白溶液表面疏水性的影響

將分別溶于0.5 mol/L和0.1 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中的新鮮肌球蛋白溶液逐步稀釋成終質(zhì)量濃度分別為0.062 5、0.125、0.25 mg/mL和0.5 mg/mL的溶液，同時(shí)加入5 mmol/L的L-Cys溶液（pH 7.0）。參照Yongsawatdigul等[31]的方法，取各質(zhì)量濃度溶液各4 mL，逐個(gè)加入8 mmol/L的ANS 40 μL，黑暗處反應(yīng)10 min，用0.5 mol/L和0.1 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl緩沖液做空白對(duì)照。熒光分光光度計(jì)狹縫校正設(shè)定為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)經(jīng)實(shí)驗(yàn)后分別設(shè)定為375 nm和475 nm，測(cè)定肌球蛋白樣品的熒光強(qiáng)度。以相對(duì)熒光強(qiáng)度對(duì)肌球蛋白濃度作圖，初始段的斜率即為肌球蛋白的表面疏水性指標(biāo)。

1.3.4 AFM樣品制備及觀察

1.3.4.1 AFM樣品的制備

提前將云母片剪成5 mm×5 mm大小，用雙面膠黏在具有鐵磁性物質(zhì)如直徑約為1 cm的鐵片上，鐵片厚度不超過1 mm；將蛋白溶液稀釋至20 μg/mL，用雙面膠將云母片外表層剝離，準(zhǔn)確吸取6 μL蛋白-L-Cys混合液滴于新剝離的云母片表面，室溫條件下在超凈臺(tái)內(nèi)自然干燥，形成蛋白吸附層；為消除鹽分的干擾，用純凈水（30 ℃，35 μL）沖洗吸附層5 次，超凈臺(tái)內(nèi)自然干燥，所有操作均在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。掃描前樣品存放在帶蓋培養(yǎng)皿中，避免空氣中的灰塵落在樣品表面干擾掃描。

1.3.4.2 AFM樣品成像

AFM探針為商用氮化硅針尖，型號(hào)為TAP 150（MPP-12100-10），操作模式為分子力模式，微懸臂的長(zhǎng)度、厚度、寬度分別為1.5～2.5、115～135、25～35 μm，共振頻率為150～200 kHz，彈性系數(shù)為5 N/m。本實(shí)驗(yàn)圖像掃描范圍均為5 μm×5 μm，每個(gè)樣品至少選取10 個(gè)不同區(qū)域進(jìn)行掃描，確保得到可重復(fù)的高質(zhì)量圖像，所有圖像均在NanoScope Analysis離線軟件上進(jìn)行，圖片只進(jìn)行Flatten平整化處理，以消除慢掃描方向上的低頻噪音造成的傾斜、扭曲、跳線等的影響，對(duì)每條掃描線進(jìn)行補(bǔ)償，使得到的圖像更加真實(shí)。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-Cys對(duì)肌球蛋白溶解度的影響

表1 L-Cys對(duì)肌球蛋白溶解度的影響Table 1 Effect of L-Cys on the solubility of myosin solutions%

表1表明L-Cys的添加能影響肌球蛋白的溶解度。未添加L-Cys時(shí)，高離子強(qiáng)度條件下肌球蛋白的溶解度均高于低離子強(qiáng)度，原因可能是靜電作用力和表面疏水性的變化改變了肌球蛋白的構(gòu)象[32]。在低離子強(qiáng)度添加L-Cys的條件下，未加熱、一段式加熱、二段式加熱時(shí)溶解度分別顯著提高了30.649%、32.483%、27.581%（P＜0.05）；高離子強(qiáng)度時(shí)則分別提高了3.732%、

4.817%、8.672%，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。該結(jié)果表明5 mmol/L的L-Cys在低鹽時(shí)作用更明顯，與周春霞等[33]的研究結(jié)果一致，高離子強(qiáng)度環(huán)境中，由于大量氯離子的存在，電荷屏蔽作用顯著，L-Cys所帶負(fù)電荷被屏蔽。Takai等[15]曾報(bào)道低離子強(qiáng)度時(shí)蛋白可能更趨向于自組裝，形成較大的纖絲體，然而低離子環(huán)境中，電荷屏蔽作用較小，L-Cys所帶負(fù)電荷圍繞在肌球蛋白周圍增加了靜電斥力，阻止了自組裝，從而提高了肌球蛋白的溶解度。另一方面，L-Cys具有還原基團(tuán)巰基（-SH）可能會(huì)改變蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的二硫鍵，影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而減弱肌球蛋白分子之間的聚集，L-Cys與肌球蛋白之間的特異性作用在低鹽條件下更顯著。

2.2 L-Cys對(duì)肌球蛋白溶液表面疏水性的影響

圖1 L-Cys對(duì)肌球蛋白溶液表面疏水性的影響Fig. 1 Eff ect of L-Cys on the surface hydrophobicity of myosin solutions

圖1表明未加熱時(shí)，在高/低鹽環(huán)境中，添加L-Cys對(duì)肌球蛋白溶液的表面疏水性均無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。一段式加熱時(shí)，高/低鹽環(huán)境中，L-Cys均能顯著提高肌球蛋白的表面疏水性（P＜0.05）。二段式加熱時(shí)，低鹽環(huán)境中，L-Cys的加入對(duì)肌球蛋白溶液的表面疏水性未產(chǎn)生顯著影響（P＞0.05）；高鹽環(huán)境中，L-Cys能顯著提高肌球蛋白的表面疏水性（P＜0.05）。當(dāng)?shù)鞍鬃冃哉归_，疏水基團(tuán)暴露，肌球蛋白的表面疏水性增大。未加熱時(shí)，肌球蛋白展開程度低，暴露的疏水位點(diǎn)較少，L-Cys作用不足以顯著改變肌球蛋白的表面疏水性。一段式加熱時(shí)，加熱溫度過高，肌球蛋白快速變性展開，暴露出大量疏水位點(diǎn)，但此時(shí)肌球蛋白的聚集速率大于展開速率，使部分疏水性位點(diǎn)重新被掩埋，但L-Cys的加入緩解了肌球蛋白的聚集，減少了疏水位點(diǎn)被掩埋，因而表現(xiàn)出較高的表面疏水性，原因可能是L-Cys特有的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)抑制肌球蛋白的聚集，與Shiraki等[17]的研究結(jié)果一致。二段式加熱時(shí)，高/低鹽環(huán)境中，L-Cys對(duì)表面疏水性的影響具有不同的趨勢(shì)，但數(shù)值上較一段式均未大幅度提高表面疏水性，原因可能是經(jīng)過預(yù)加熱階段肌球蛋白充分展開，展開速率大于聚集速率，在低溫凝膠化階段肌球蛋白通過二硫鍵和疏水鍵發(fā)生有序聚集形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[33]，再經(jīng)90 ℃加熱時(shí)疏水性位點(diǎn)相比一段式加熱被掩埋的相對(duì)較少，從而L-Cys對(duì)肌球蛋白表面疏水性的影響弱于一段式加熱，此時(shí)加熱對(duì)表面疏水性的影響占主導(dǎo)地位而不是L-Cys。

2.3 L-Cys對(duì)肌球蛋白聚集行為表面形貌的影響

2.3.1 緩沖液及L-Cys溶液AFM成像

圖2 緩沖液和L-Cys溶液AFM成像Fig. 2 AFM images of buffer solution and L-Cys solutions

由圖2A可以看出，緩沖液在云母片表面形成的吸附層在經(jīng)過沖洗去鹽后表面無(wú)明顯顆粒狀雜質(zhì)，無(wú)污染、非常平滑，因此樣品在自然干燥過程中空氣中的塵埃顆粒及析出的鹽分顆粒對(duì)樣品觀測(cè)的影響不大；圖2a在高度上進(jìn)一步反應(yīng)出緩沖液吸附層表面無(wú)明顯雜質(zhì)顆粒。圖2B為將L-Cys溶解在緩沖液中形成的L-Cys溶液在云母片上形成的吸附層，可以看出L-Cys溶液不存在大的顆粒狀物質(zhì)，與蛋白顆粒形貌存在較大的區(qū)別；圖2b表明L-Cys溶液顆粒細(xì)小且均勻，與蛋白聚集體高度圖差別較大。

2.3.2 高鹽條件下L-Cys對(duì)肌球蛋白聚集行為的影響

圖3 高鹽條件下肌球蛋白溶液和添加L-Cys對(duì)肌球蛋白溶液熱聚集行為的影響Fig. 3 Effect of L-Cys on the heat-induced aggregation of myosin solutions at high ionic strength

由圖3A、a可以看出，未加熱時(shí)肌球蛋白多以單體或小聚集體的形式吸附在云母片的表面，分布相對(duì)均勻，存在輕微的交聯(lián)現(xiàn)象。圖3B、b顯示一段式加熱時(shí)，肌球蛋白形成大的聚集體，大小不等的聚集體分布很不均勻，圖像表明肌球蛋白發(fā)生無(wú)序且劇烈的聚集，產(chǎn)生橫向交聯(lián)，形成不規(guī)則的簇狀聚集體，原因可能是加熱溫度過高，肌球蛋白聚集速率大于展開速率。圖3C、c顯示二段式加熱時(shí)形成大的聚集簇，部分小的聚集體發(fā)生交聯(lián)從而進(jìn)一步聚集成大的聚集體，蛋白聚集體的分布相對(duì)均勻。由圖3D、d可以看出，未加熱添加L-Cys后肌球蛋白多以小的聚集體或單體的形式存在，與純蛋白相比小的聚集體數(shù)量增多，與溶解度結(jié)果一致，且分布不均勻，未出現(xiàn)輕微交聯(lián)現(xiàn)象，表明L-Cys在未加熱時(shí)干擾了肌球蛋白的聚集。圖3E、e結(jié)果顯示，一段式加熱時(shí)出現(xiàn)較大的聚集體，聚集體的大小形狀較純蛋白均勻，并且表現(xiàn)出明顯的有序聚集，說明L-Cys緩解了肌球蛋白在一段式加熱時(shí)產(chǎn)生的劇烈聚集。圖3F、f顯示二段式加熱時(shí)，L-Cys對(duì)肌球蛋白溶液的聚集行為有明顯的影響，與純蛋白相比聚集體更小，分布更均勻，阻止了肌球蛋白聚集體發(fā)生橫向聚集，未形成大的聚集體，與Shiraki等[17]曾報(bào)道的氨基酸能阻止蛋白的聚集結(jié)果一致。

2.3.3 低鹽條件下L-Cys對(duì)肌球蛋白聚集行為的影響

圖4 低鹽條件下肌球蛋白溶液和添加L-Cys對(duì)肌球蛋白溶液熱聚集行為的影響Fig. 4 Effect of L-Cys on the heat-induced aggregation of myosin solutions at low ionic strength

由圖4A可以看出，肌球蛋白低鹽條件未加熱時(shí)自組裝成較小的聚集體，與高鹽相比聚集體分布不均勻，形狀不規(guī)則，但橫向交聯(lián)明顯增多（圖4a），原因可能是低鹽條件下肌球蛋白更趨向于自組裝成較大的肌球蛋白纖絲[16]。一段式加熱時(shí)出現(xiàn)較大的肌球蛋白聚集體，較高鹽條件下分布較均勻，形狀較規(guī)則（圖4B、b）。二段式加熱時(shí)出現(xiàn)較小的聚集體，分布較均勻，與高鹽條件下聚集形貌表現(xiàn)出較大區(qū)別（圖4C、c）。由圖4E、e可以看出，未加熱時(shí)添加L-Cys后肌球蛋白分散更均勻，小的纖絲體增多，原因可能是L-Cys提高了肌球蛋白的溶解度，較大的纖絲體分解成較小的纖絲體或單體，該結(jié)果與溶解度結(jié)果一致。圖4E、F也可看出添加L-Cys后聚集體明顯減小，與溶解度結(jié)果一致，同時(shí)蛋白聚集體的橫向交聯(lián)增加，說明L-Cys在緩解肌球蛋白聚集的同時(shí)使其聚集更有序，避免聚集速率過快，形成大的蛋白簇，而且簇與簇間的交聯(lián)能力明顯上升，利于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。

3 結(jié) 論

3 種加熱方式下，低鹽環(huán)境中，L-Cys均能顯著提高肌球蛋白的溶解度；高鹽環(huán)境中，L-Cys的添加對(duì)肌球蛋白的溶解度無(wú)顯著性影響。未加熱時(shí)，高/低鹽環(huán)境中L-Cys對(duì)肌球蛋白溶液表面疏水性均無(wú)顯著性影響；一段式加熱時(shí)，高/低鹽環(huán)境中，添加L-Cys均顯著提高了肌球蛋白溶液的表面疏水性；二段式加熱時(shí)，相對(duì)一段式加熱L-Cys均未大幅度改變表面疏水性。AFM圖像顯示高鹽條件下添加L-Cys使蛋白聚集體分布更均勻，聚集體更小，緩解了肌球蛋白的聚集，使其聚集更有序；低鹽條件下L-Cys使肌球蛋白分布更分散但不均勻，聚集體更小，橫向交聯(lián)明顯增加，有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成。

L-Cys本身帶負(fù)電荷，與肌球蛋白自身的負(fù)電荷形成干擾，破壞了靜電平衡，從而影響肌球蛋白的聚集行為。低鹽時(shí)，電荷屏蔽作用弱，L-Cys所帶負(fù)電荷圍繞在肌球蛋白周圍，增大了靜電斥力，從而顯著提高了肌球蛋白的溶解度；一段式加熱時(shí)，肌球蛋白的聚集速度大于展開速度，L-Cys可顯著緩解肌球蛋白的聚集，使被掩埋的疏水位點(diǎn)重新暴露，從而顯著提高了表面疏水性；二段式加熱時(shí)，預(yù)加熱過程肌球蛋白充分展開，且展開速度大于聚集速度，發(fā)生有序聚集，疏水位點(diǎn)被掩蓋的較少，加熱方式對(duì)表面疏水性的影響大于L-Cys。此外，L-Cys特殊的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)與肌球蛋白發(fā)生特異性作用，也會(huì)干擾肌球蛋白的聚集行為，還需要進(jìn)一步的研究。