雙波長瑞利光散射技術測定食品中的Cu

江 虹，王 芳，吳征真，曾慶瑞

（長江師范學院化學化工學院，武陵山片區綠色發展協同創新中心，重慶 408100）

Cu是人體必需的微量元素之一，對維持機體的正常代謝具有重要作用，它參與多種酶的構成，參與造血及形成色素，影響中樞神經系統、內分泌、生殖及免疫機能。若人體內缺Cu，會發生貧血、腹瀉、頭暈、眼花、耳鳴、乏力、生長停滯、骨質疏松、冠心病和糖尿病等疾?。蝗羧梭wCu過量，則會引起惡心、嘔吐、上腹疼痛等中毒現象[1]。人體中的Cu主要從日常飲食中攝入，而日常食品如餅干、面條、奶粉等通常由于加工中使用Cu器設備而受到污染，因此研究食品中Cu具有重要意義。

目前測定Cu的方法主要有：原子吸收法[2-6]、電感耦合等離子體質譜法[7-10]、電化學法[11-21]、分光光度法[22-27]、熒光法[28-30]等。原子吸收法因分析成本高，所用儀器價格較貴而不易普及。電感耦合等離子體質譜法有較高的靈敏度和準確度，但分析成本高、儀器貴，仍不易普及。其他方法或靈敏度較低或實驗條件要求較苛刻或分析成本較高。瑞利光散射（Rayleigh light scattering，RLS）技術是近年新發展起來的一種高靈敏分析技術，在食品分析方面應用較少，尤其是用雙波長瑞利光散射（dual-wavelength Rayleigh light scattering，DWO-RLS）法測定食品中Cu的含量，目前尚鮮見文獻報道。本實驗以溴甲酚綠（bromocresol green，BRG）作探針，在酸性溶液和陽離子表面活性劑——溴代十六烷基吡啶（hexadecylpyridinium bromide，TPB）存在下，用DWORLS技術測定Cu的含量，得到較滿意的結果。實驗發現，該體系的譜線上有兩個較大的散射峰，在最大和次大散射波長處Cu（II）的質量濃度在一定范圍內與體系的RLS猝滅程度（ΔIRLS）有線性關系，該方法簡便、快速、靈敏，適于食品中Cu的快速測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈣奶餅干（1#）、兒童營養餅干（2#）、餅干（3#、4#）、面條（5#、6#）、幼兒配方奶粉（7#、8#）、嬰兒配方奶粉（9#、10#） 市售；TPB 上海乙基化工有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris） 齊一生物科技（上海）有限公司；BRG 天津市科密歐化學試劑有限公司；Cu(NO3)2·3H2O（99.9%） 國藥集團化學試劑有限公司；超純水；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

F-2500型熒光分光光度計 日本日立公司；pHS-3C精密酸度計 上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

C u（I I）標準溶液：準確稱取一定量的Cu(NO3)2·3H2O于小燒杯中，用水溶解，配成6.355 mg/L貯備液，工作液為0.6355 mg/L。BRG溶液：稱取適量溴甲酚綠于小燒杯中，加少量無水乙醇使其溶解，再轉移至1 000 mL容量瓶中，用水定容，配成1.0×10-3mol/L的溶液，工作液為1.0×10-4mol/L。TPB溶液：稱取適量的TPB，加少量無水乙醇溶解，用水稀釋配成4.00×102mg/L。Tris-鹽酸溶液：將適量的0.10 mol/L鹽酸溶液與適量的0.20 mol/L Tris溶液混合，用酸度計測定，配成pH 3.0～8.5的Tris-鹽酸溶液。

1.3.2 樣品處理

在電子天平上用固定質量稱量法準確稱取1.1節中已搗碎、混勻、并按四分法縮分的1#樣品5.000 0 g，2#～10#樣品各10.000 0 g（允許誤差±0.0001 g）于各瓷坩堝中，置于可調電爐上，在低溫下加熱至樣品完全炭化后，再將溫度調至500～550 ℃，灼燒灰化約5 h，冷卻后，取出坩堝，用體積比為1∶1 HNO3溶液（取50 mL濃HNO3置于適量水中，再用水稀釋至100 mL）2.0 mL潤濕灰分，再在電爐上低溫加熱蒸干，然后在500～550 ℃條件下灼燒約2 h，冷卻后，取出坩堝，加入1∶1 HNO3溶液2.0 mL，水8 mL，攪拌，低溫加熱使灰分完全溶解，待冷卻后，過濾，濾液置于100 mL容量瓶中，再加1∶2三乙醇胺溶液（三乙醇胺和水的體積比為1∶2）（掩蔽Fe3+、Al3+）3.0 mL，用水稀至刻度，即為待測液。

1.3.3 RLS強度的測定

在具塞比色管中，依次準確加入1.0 0 m L pH 4.81 Tris-鹽酸溶液，3.00 mL 1.0×10-4mol/L BRG溶液，0.20 mL 4.00×102mg/L TPB溶液及適量的0.6355 mg/L Cu（II）標準溶液（或樣液），用超純水稀釋至10.0 mL刻度，搖勻，35 min后，將溶液于熒光光度計上（λex=λem=220 nm）進行同步掃描（測定狹縫5 nm），得光譜，記錄最大波長528 nm和次大波長361 nm處體系和試劑空白的RLS強度IRLS（528 nm）、IRLS（361 nm）及I0（528 nm）、I0（361 nm），按照以下公式進行計算：

2 結果與分析

2.1 Cu（II）-TPB-BRG的RLS光譜

圖1 BRG-Cu（II）-TPB的RLS光譜Fig.1 RLS spectra of bromocresol green-Cu(II)-cetylpyridine bromide

從圖1可知，Cu（II）、BRG及TPB溶液在實驗測定條件下，其自身的RLS光譜十分微弱（曲線1～3），BRG在Tris-鹽酸的酸性溶液中的RLS也很微弱（曲線4），TPB在Tris-鹽酸的酸性溶液中較微弱（曲線5）。當BRG與TPB在酸性Tris-鹽酸溶液中混合后RLS信號顯著增強（曲線6），光譜曲線上出現3 個明顯的RLS峰，最大峰位于528 nm，次大峰位于361 nm，相對最小的散射峰位于306 nm；RLS增強的原因主要：BRG是一種酸性染料，其分子結構上有2 個可離解的酚基氫，在溶液中離解后帶負電荷，而TPB是一種陽離子表面活性劑，其分子結構上有1個可離解的Br-，在溶液中離解后帶正電荷，在實驗條件下，帶正電荷的陽離子表面活性劑TPB以預膠束聚集體存在，而帶負電荷的BRG則在其表面聚集，從而導致RLS光譜急劇增加，這也表明TPB可增敏BRG，生成離子締合物，使RLS增強。當在BRGTPB的酸性Tris-鹽酸溶液中加入不同濃度的Cu（II）標準溶液后，在最大、次大和最小散射波長處，隨著Cu（II）濃度的不斷增大，BRG-TPB-Cu（II）體系的RLS強度不斷降低，即Cu（II）的加入使體系的RLS發生猝滅作用（曲線6～12）。猝滅原因：Cu（II）的加入，破壞了BRG-TPB締合物原有的平衡，部分BRG轉而與Cu（II）結合，從而導致BRG與TPB的分離，結果使RLS降低。實驗表明，在361 nm和528 nm處，無論是用單波長法測定還是用DWO-RLS測定，Cu（II）在一定濃度范圍內其質量濃度與BRG-TPB-Cu（II）體系的猝滅程度ΔIRLS呈線性關系（曲線6～12），但用DWO-RLS測定時，其靈敏度約為單波長法的2 倍，故選擇用DWO-RLS法定量測定Cu（II）。

2.2 反應條件的選擇

2.2.1 介質酸度的影響

室溫條件下，考察在不同pH值的Tris-鹽酸介質存在下，對BRG-TPB-Cu（II）體系ΔIRRS的影響。結果表明：BRG-TPB的RLS受酸度的影響較小，但加入Cu（II）后，BRG-TPB-Cu（II）體系的RLS受酸度的影響則較大。圖2為加入Cu（II）后，在528、361 nm 及（528+361）nm 波長處，BRG-TPB- Cu（II）體系的RLS增強強度（或猝滅程度）的絕對值│ΔIRLS│隨溶液pH值的變化情況。圖2不僅表明適宜酸度范圍為pH 4.2～5.3（在該范圍內，體系的猝滅程度較大，即│ΔIRLS│較大，靈敏度較高），還表明用DWO-RLS法測定的靈敏度比單波長法更高。故實驗用DWO-RLS法進行測定，使用pH 4.81的Tris-鹽酸溶液作反應介質，適宜用量為1.00 mL。

圖2 pH值的影響Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLS

2.2.2 BRG溶液濃度的影響

圖3 BRG濃度的影響Fig.3 Effect of bromocresol green concentration on ΔIRLS

從圖3可知，當BRG溶液的濃度增加到3.00×10-5mol/L時，Cu（II）的加入使體系的猝滅作用達到最大，即│ΔIRLS│最大，靈敏度相對最高。同時圖3也表明，用DWO-RLS法測定，其靈敏度比單波長法高。故實驗采用DWO-RLS法進行測定，選用1.00×10-4mol/L BRG溶液的濃度為3.00 mL。

2.2.3 表面活性劑的影響

室溫條件下，考察TPB、溴化十六烷基三甲基銨、十二烷基硫酸鈉、十二烷基磺酸鈉、Tween-20、Triton X-100等對BRG-TPB-Cu（II）體系ΔIRLS的影響。結果表明，只有TPB和溴化十六烷基三甲基銨對體系有增敏性，尤以TPB效果最好。繼而研究了不同濃度的TPB溶液對BRG-TPB- Cu（II）體系ΔIRLS的影響，結果表明：當TPB濃度為8.00 mg/L時，Cu（II）的加入使體系的猝滅作用達最大，即│ΔIRLS│最大，靈敏度相對最高。同理，用DWO-RLS法測定的靈敏度比單波長法高，故實驗用DWORLS法進行測定，使用4.00×102mg/L TPB溶液0.20 mL。

2.2.4 試劑加入順序的影響

室溫條件下，考察在優化的反應條件下試劑在不同加入順序時對BRG-TPB- Cu（II）體系ΔIRLS的影響。結果表明，按1.3.3節DWO-RLS強度的測定中的試劑加入順序為最佳。故實驗按Tris-鹽酸溶液、BRG溶液、TPB溶液、Cu（II）標準溶液的順序加入各試劑。

2.2.5 體系的反應速度及穩定性

室溫條件下，考察BRG-TPB- Cu（II）體系在不同反應時間對ΔIRLS的影響。結果表明，BRG與TPB的反應很快就能完成，當加入Cu（II）溶液后，隨著時間的延長，體系的RLS強度逐漸降低，35 min后RLS信號趨于穩定，穩定時間至少可保持1.5 h。即BRG、TPB及Cu（II）之間在35 min內可以反應完全，故實驗選在35 min后測定。

2.3 標準曲線及相關參數

在優化條件下，按DWO-RLS強度的測定方法配制Cu（II）的標準系列溶液，并掃描RLS光譜。以ΔIRLS對相應的Cu（II）的質量濃度（ρ）作圖繪制標準曲線。標準曲線的一元線性回歸方程、相關系數、線性范圍及方法的檢出限見表1。由表1可知，用DWO-RLS法測定的靈敏度比單波長法高。

表1 標準曲線相關參數Table1 Calibration standard curves, LODs and LOQs

2.4 方法的選擇性

在0.063 6 mg/L Cu（II）存在下，用DWO-RLS法考察了某些常見陰、陽離子對Cu（II）測定的影響，結果見表2。由表2可知，除Fe3+、Al3+的允許量相對較小，可能有一定的干擾外，其他陰、陽離子均不干擾測定。而Fe3+、Al3+的干擾可加入1∶2的三乙醇胺溶液1.0 mL予以掩蔽。故該方法具有好的選擇性。

表2 共存物質的影響Table2 Effect of coexisting substances

2.5 樣品分析結果

表3 樣品分析結果及回收實驗（n=5）Table3 Recoveries of Cu from spiked real samples (n= 5)

取1.3.2節中的待測樣液各2.00 mL，按DWO-RLS強度的測定方法加入各試劑溶液并掃描RLS光譜，各平行測定5份，根據測得的ΔIRLS，在DWO-RLS法的標準曲線或回歸方程上求得各待測樣液的濃度并推至原始樣品的含量。同時作加標回收實驗，各平行測定5份，求出平均回收率。由表3可知，本法測定結果與GB/T 5009.13—2003《食品中銅的測定》中的火焰原子吸收法基本一致，回收率為98.6%～103%，相對標準偏差為1.8%～2.5%，結果表明，方法有較高的準確度和精密度。

3 結 論

定量檢測Cu含量的DWO-RLS法與國標法中的火焰原子吸收法相比，對儀器的要求和儀器的使用成本更低，操作更簡便、快速；而靈敏度方面，國標法中的火焰原子吸收法的檢出限為1.0 mg/kg，本體系的單波長法在361 nm和528 nm處的檢出限分別為9.81 ng/mL和8.62 ng/mL，雙波長法的檢出限為4.61 ng/mL，由此可知，無論是單波長法還是雙波長法其靈敏度均比國標法好，其中又以雙波長法更靈敏。除此之外，本法有較寬的線性范圍，準確度、精密度及選擇性均能較好的滿足痕量分析要求。方法所用試劑價廉易得，樣品處理安全、可靠，適于多種食品中Cu的快速測定。