pH偏移結合熱處理對大豆蛋白柔性與乳化性的影響

王 健，徐曄曄，于 潔，高婷婷，王喜波*，江連洲

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）因其良好的功能性質、營養價值及潛在的健康益處而成為國內外的研究熱點并被廣泛應用于食品的多個領域[1-3]。蛋白質的柔性可以理解為蛋白質所處外部環境變化時，其結構能夠發生改變的能力，反映出蛋白質結構對環境變化的敏感性[4-6]。因其在決定蛋白功能性質尤其是界面性質中的關鍵作用而受到越來越多學者的關注。耿蕊等[7]研究發現pH偏移結合加熱處理在一定程度上改善了SPI的乳化性。Jiang Jiang等[8]研究發現，SPI經過酸性pH偏移處理后會形成“熔球態”的結構，即在保持蛋白原有二級結構不變的基礎上，其三級結構和四級結構發生了改變，在這種狀態下SPI的乳化能得到了顯著的提升。但目前鮮見從蛋白柔性的角度研究pH偏移結合熱處理對SPI結構與功能性質關系的影響的報道。

以SPI對胰蛋白酶的敏感性表征量化柔性，研究pH偏移結合熱處理對SPI柔性的影響，并探索SPI柔性與乳化性質的相關性，為進一步探索柔性在蛋白結構和功能性質中的作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 東北農業大學大豆研究所；大豆油 九三集團哈爾濱惠康食品有限公司；三氯乙酸 永華精細化學品有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)methyl aminomethan，Tris）、胰蛋白酶、8-苯氨基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid, azane, hydrate，ANS）熒光探針 美國Sigma公司；5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 美國Merck公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

T18 Basic型高速分散機/勻漿機 德國IKA公司；LD4-2A低速離心機 北京醫用離心機廠；TU-1800型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；ALPHA 1-4 LSC型冷凍干燥機 德國Christ公司；ALC-310.3型分析天平 德國艾科勒公司；UV2600紫外分光光度計 美國布魯克海文儀器公司；F-4500熒光分光光度計 日本日立公司；HH-6恒溫數顯水浴鍋常州賽普實驗儀器廠；DSX-208B滅菌鍋 上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 SPI制備

參照Sorgentini等[9]的方法并略作改動。原料大豆用粉碎機粉碎后過60 目篩，索氏抽提，脫脂后的低溫脫脂豆粕與蒸餾水以質量比1∶10的比例混合，調體系pH值至8.5，室溫低速攪拌2 h。離心（4 000×g）20 min，取上清液，調pH值至4.5，4 ℃靜置過夜，取沉淀進行離心（4 000×g，5 min），水洗沉淀2 次，復溶后調pH值至7.0，預凍后進行冷凍干燥。

1.3.2 SPI成分測定

蛋白含量：參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》凱氏定氮法測定；水分含量：參考GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》直接干燥法測定；灰分含量測定：參考GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；粗脂肪含量測定：參考GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》。

1.3.3 樣品前處理

將SPI溶于去離子水，質量濃度為20 mg/mL，22 ℃攪拌2 h，10 000 r/min分散處理1 min，靜置12 h。

1.3.4 樣品處理

將制備好的樣品調pH值分別為pH 2.0、pH 7.0和pH 11.0。溫度分別為90、120 ℃處理15 min，迅速冰水冷卻5 min后調pH值至7.0備用。

1.3.5 柔性測定

參照Kato等[10]的方法略作修改。利用SPI對胰蛋白酶的敏感性來表征柔性。取250 μL1 mg/mL（0.05 mol/L、pH 8.0 Tris-HCl緩沖液）酶液加入到4 mL1 mg/mL處理后SPI蛋白溶液中（蛋白∶酶=16∶1），38 ℃保溫酶解5 min，酶解反應結束后，加4 mL 5%三氯乙酸終止反應，離心后取上清液測定其在波長280 nm吸光度，用吸光度A表征量化柔性。

1.3.6 濁度測定

參照Kurganov等[11]的方法并略作改動，將處理后的SPI樣品溶液稀釋至3 mg/mL，混合均勻后在波長400 nm處測定其吸光度，所得吸光度表示濁度，所有測定結果重復3 次。

1.3.7 游離巰基含量測定

參照Beveriger等[12]的方法并略作改動。取1 mL不同條件處理后SPI樣品（10 mg/mL）加入到5 mL的Tris-甘氨酸緩沖溶液（0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.004 mol/L乙二胺四乙酸、8 mol/L尿素，pH 8.0）中，然后加入20 μL DTNB試劑，振蕩混勻，在室溫條件下靜止反應15 min，在波長412 nm處測定吸光度，以不加DTNB的溶液做空白調零。游離巰基濃度按公式（1）計算：

式中：A412nm為412 nm波長處的吸光度；C為固形物質量濃度/（mg/mL）；D為稀釋系數。

1.3.8 表面疏水性測定

參照Schmal等[13]方法并略作改動。用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將SPI樣品溶液稀釋到樣品質量濃度分別為0.1、0.05、0.0025 mg/mL和0.001 25 mg/mL，加入20 μL的ANS（8 mmol/L，溶于0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液，pH 7.0）熒光探針，混勻后在室溫條件下避光15 min后測定SPI樣品的熒光強度，同時設定激發波長為390 nm，發射波長為470 nm，狹縫寬度5 nm，測得的熒光強度對蛋白溶液濃度作圖，選擇線性關系良好的回歸線的斜率作為蛋白質表面疏水性指數。

1.3.9 粒徑測定

將處理過后的SPI樣品用去離子水稀釋到1 mg/mL，在粒度測定儀上進行粒度的測定，每個蛋白樣品檢測3次。

1.3.10 紫外掃描

參照Liang Hanni等[14]的方法并略作改動。處理后的SPI樣品稀釋至0.2 mg/mL后進行紫外掃描，掃描波長范圍190～500 nm，掃描速率100 nm/min，分辨率0.2 nm，所有測定結果重復3 次。

1.3.11 內源性色氨酸熒光光譜測定

參照Liu Yan等[15]的方法并略作改動。處理后的SPI樣品稀釋到0.2 mg/mL進行測定，同時設定激發波長為290 nm，發射波長范圍為300～460 nm，狹縫寬度均為2.5 nm，電壓為700 mV進行熒光光譜掃描，所有測定結果重復3 次。

1.3.12 乳化性測定

參照Tang等[16]的方法。將處理后的SPI蛋白樣品稀釋到2 mg/mL，處理后蛋白樣品與大豆油以體積比3∶1混合，分散機（10 000 r/min）處理1 min，迅速吸取底部乳液50 μL加入到5 mL 0.1% SDS溶液中，在旋渦混合器上混合均勻。分別測定0 min和10 min吸光度，乳化活性用吸光度A0表示，乳化穩定性按公式（2）計算：

式中：A0為0 min時測得的吸光度；A10為10 min時測得的吸光度。

1.4 數據統計分析

每次實驗做3 次平行，結果以 ±s表示，數據間差異顯著性采用SPSS 17.0進行統計分析，實驗數據用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 SPI的組成

表1 SPI的基本成分及含量Table1 Proximate composition of SPI

如表1所示，實驗所制得的SPI蛋白質、水分、灰分和粗脂肪質量分數分別為（90.22±0.44）%、（3.24±0.67）%、（3.39±0.53）%和（0.47±0.06）%，符合實驗要求。

2.2 不同pH偏移結合熱處理對SPI柔性影響

圖1 不同pH偏移結合熱處理對SPI柔性的影響Fig.1 Eeffect of pH-shifting combined with heating treatment on flexibility of SPI

由圖1可知，在各個pH偏移處理條件下，SPI柔性隨著處理溫度的升高而增大，在處理溫度為90 ℃時，pH 2.0和pH 7.0偏移處理條件下柔性無顯著性差異，而pH 11.0處理條件下，柔性則顯著上升。處理溫度為120 ℃時，pH 11.0偏移處理條件下SPI柔性最高，其次分別為pH 2.0和pH 7.0。pH 2.0和pH 11.0偏移處理結合熱處理促進了SPI在加熱過程中柔性的增加，其中pH 11.0偏移處理結合熱處理對柔性影響更為強烈。單獨的pH 2.0和pH 11.0偏移處理會導致柔性輕微的上升，已有研究表明酸堿度的變化可以引起SPI結構的變化[17]，Ishino等[18]研究發現SPI溶液在pH值大于11.0的堿性條件下會發生蛋白構象變化而變性。pH偏移結合熱處理能有效破壞SPI分子天然的剛性結構，導致SPI柔性的增加。

2.3 不同pH偏移結合熱處理對SPI表面疏水性影響

圖2 不同pH偏移結合熱處理對SPI表面疏水性的影響Fig.2 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on surface hydrophobicity of SPI

SPI分子內的疏水相互作用是維系其三級結構的主要作用力，它對蛋白結構的穩定具有關鍵作用。由圖2可知，在各個pH偏移處理條件下，處理溫度為90 ℃時，SPI表面疏水性顯著上升，隨后當處理溫度為120 ℃時，表面疏水性卻顯著降低。與其他處理條件相比，SPI在pH 7.0、90 ℃處理條件時表面疏水性最高，這與顧龍建等[19]的結果相似，研究發現90 ℃熱處理會導致SPI表面疏水性的增加。Wang Jinmei等[20]認為SPI在90 ℃條件下進行熱處理時可以導致SPI蛋白的變性，其結構更加舒展，原來隱藏在分子內層的疏水性基團暴露出來，所以SPI表現出很高的表面疏水性。相反，在120 ℃處理SPI時，蛋白之間產生的過度疏水作用導致聚集體形成，從而導致SPI表面疏水性降低。

而單獨pH 2.0和pH 11.0偏移處理會導致SPI表面疏水性的增加，其中pH 2.0偏移處理增加幅度更大，原因可能是酸堿偏移處理可以使SPI蛋白結構舒展，蛋白不能完全恢復最初的天然狀態，從而暴露出分子內部部分疏水性基團，導致表面疏水性的增加。

2.4 不同pH偏移結合熱處理對SPI游離巰基含量影響

圖3 不同pH結合熱處理對SPI游離巰基含量的影響Fig.3 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on the content of free sulfhydryl groups in SPI

有2 種情況會導致蛋白分子中游離巰基含量的改變，一種情況是蛋白由于外界作用導致結構展開，原來在分子內部巰基的暴露。另一種情況可能是蛋白亞基的解離導致二硫鍵斷裂從而生成新的游離巰基[18]。一般來說，游離巰基含量變化意味著蛋白結構改變，由圖3可知，在pH 7.0條件下，熱處理溫度的上升會導致SPI游離巰基含量的上升，相反，在pH 2.0和pH 11.0偏移處理條件下熱處理溫度的升高會導致SPI游離巰基含量的降低，可能的解釋是由于熱處理，SPI分子內或分子間形成二硫鍵，同時還可能伴隨有氧化反應的發生，從而使得巰基含量下降[23]。而單獨pH 2.0和pH 11.0偏移處理會導致SPI游離巰基含量的下降，這與耿蕊等[19]的研究一致。另外，Hwang等[24]研究發現，酸處理能夠顯著降低大豆蛋白的二硫鍵，使巰基含量升高。在pH 7.0條件下游離巰基含量隨處理溫度的升高而增加，可能是由于熱處理導致二硫鍵的斷裂，而二硫鍵的斷裂，可能是造成pH 7.0條件下柔性上升的主要原因[25]。

在pH 2.0和pH 11.0偏移處理條件下，120 ℃熱處理使SPI蛋白擁有柔性更高的構象，而表面疏水性和游離巰基含量卻下降，可能的解釋是由于120 ℃熱處理導致SPI發生疏水相互作用形成聚集體，此過程使部分游離巰基內卷于聚集體內部，而非形成新的二硫鍵，維持了蛋白的柔性構象[20]。

2.5 不同pH偏移結合熱處理對SPI濁度影響

圖4 不同pH偏移結合熱處理對SPI濁度的影響Fig.4 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on turbidity of SPI

由圖4可知，在pH 7.0條件下，熱處理溫度的上升會導致SPI濁度的上升。在pH 2.0偏移處理條件下，處理溫度為90 ℃時，SPI濁度達到最大，在120 ℃時又略有下降。在pH 11.0偏移處理條件下，熱處理溫度的上升會導致SPI濁度的下降。在pH 7.0條件下，熱處理導致蛋白分子之間形成聚集體，故濁度上升。pH 2.0偏移處理條件下濁度顯著增大的變化趨勢可能是由于在調pH值回7.0過程中，蛋白重新形成了較大的聚集體，導致體系中濁度增大。

在pH 11.0偏移處理條件下，熱處理溫度的上升會導致SPI濁度顯著下降，可能是由于堿性條件下，SPI分子中亞基解離，這一點在粒度分析和內源性色氨酸熒光光譜分析中得到了證實，而亞基的解離，可能是pH 11.0偏移結合熱處理使SPI柔性顯著上升的原因之一。

2.6 不同pH偏移結合熱處理對SPI粒徑影響

圖5 不同pH偏移結合熱處理對SPI粒徑的影響Fig.5 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on particle size of SPI

由圖5可知，在pH 7.0條件下，SPI粒徑會隨著處理溫度的升高而降低，這與濁度的結果相反。在pH 2.0偏移處理條件下處理溫度為90 ℃會導致SPI粒徑的降低，而當處理溫度為120 ℃時SPI粒徑明顯增大，表明120 ℃處理導致SPI分子間發生了聚集，導致較大聚集體的形成。在pH 11.0偏移處理條件下，與pH 7.0未經熱處理的條件相比，SPI粒徑明顯降低，表明在pH 11.0條件下SPI解離，蛋白粒子變小，這與體系濁度變化趨勢一致。在pH 11.0偏移處理條件下，90 ℃熱處理會導致SPI粒徑的降低，而120 ℃熱處理則導致SPI粒徑略有增加，這可能是源于部分解聚的SPI蛋白質分子重新生成新的聚集體導致SPI平均粒度增大。單獨pH 2.0和pH 11.0偏移處理會導致SPI粒徑的降低。pH 11.0偏移處理結合熱處理造成SPI蛋白粒度的降低，表明SPI蛋白分子發生了解離，這可能是造成SPI柔性增加的原因之一。

2.7 不同pH偏移結合熱處理對SPI內源性色氨酸熒光光譜分析

圖6 不同pH偏移結合熱處理對SPI內源性色氨酸熒光光譜Fig.6 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on typical intrinsic emission fluorescence spectrum of SPI

由圖6可知，在pH 7.0條件下，SPI內源性熒光強度隨著處理溫度的上升而減弱，在pH 2.0偏移處理條件下，SPI內源性熒光強度也隨著處理溫度的上升而減弱，但降低幅度比在pH 7.0條件下更大，推測可能是在pH 2.0偏移處理條件下，由于聚集體的形成，發色基團重新隱藏在SPI分子內部導致熒光強度的降低（2.5節和2.6節結果）。在pH 11.0偏移處理條件下，90 ℃處理溫度會導致內源性熒光強度增加，但在處理溫度為120 ℃時又略有下降。單獨pH 2.0和pH 11.0偏移處理會導致SPI內源性色氨酸熒光強度增加。已有研究表明，蛋白在發生亞基解離的時候，內源熒光掃描的最大吸收波長會向長波長的方向移動（紅移）[26]。由圖6可知，在pH 11.0偏移處理條件下，SPI內源熒光掃描的最大吸收波長向長波長方向明顯移動，這說明SPI在pH 11.0偏移處理條件下發生了亞基的解離，其中熱處理會促進亞基的解離。

2.8 不同pH偏移結合熱處理對SPI紫外掃描光譜分析

由圖7可知，在pH 7.0條件下，隨著處理溫度的上升，SPI紫外吸收強度也隨之上升，這與柔性的變化趨勢一致，紫外吸收強度的增加表明SPI分子內部發色基團暴露在外部，SPI結構變得更加舒展。在pH 2.0偏移處理條件下，未進行熱處理的SPI紫外吸收強度明顯上升，表明單獨的pH 2.0偏移處理會造成SPI結構的改變，熱處理為90 ℃和120 ℃時會導致pH 2.0偏移處理條件下SPI紫外吸收強度的降低，推測可能是由于聚集體的形成（2.5節和2.6節結果）。聚集體的形成導致暴露在外部發色基團重新隱藏在分子內部。在pH 11.0偏移處理條件下，熱處理會造成SPI紫外吸收強度的降低，可能是由于濁度的降低從而導致紫外吸光度的降低。

圖7 不同pH偏移結合熱處理下SPI紫外圖譜Fig.7 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on UV spectrum of SPI

2.9 不同pH偏移結合熱處理對SPI乳化活性和乳化穩定性影響

圖8 不同pH偏移結合熱處理對SPI乳化活性（A）和乳化穩定性（B）的影響Fig.8 Effect of pH-shifting combined with heating treatment on emulsifying activity (A) and emulsion stability (B) of SPI

由圖8可知，在各個pH偏移處理條件下，SPI乳化活性和乳化穩定性隨著處理溫度的升高而增加，pH 2.0和pH 11.0偏移處理結合熱處理有利于SPI乳化性質（乳化活性和乳化穩定性）的增加。這與柔性變化趨勢一致。pH偏移結合熱處理使蛋白分子逐漸展開，分子的形態由緊密的球型結構向松散結構轉換，蛋白具有更好的柔性，更加有利于蛋白吸附在油水界面上并展開[27-28]。Tang Chuanhe等[29]認為柔性的增加有利于牛血清蛋白界面的初始吸附和隨后的結構重排，從而增加了蛋白的乳化活性。Matsudomi等[30]研究發現，極端酸性pH偏移處理對SPI的結構和表面性質有顯著影響。Jiang Jiang等[8]也發現酸性pH偏移處理可引發SPI的結構向熔球態結構轉變，造成其乳化性的改善。部分變性和/或展開的蛋白通常表現為蛋白柔性的增強（相對于天然蛋白），這將有利于它們的乳化性能的提高。

2.10 不同pH偏移結合熱處理條件下SPI柔性與乳化性的相關關系

圖 9 不同pH偏移結合熱處理條件下柔性與乳化活性（A）和乳化穩定性（B）的關系Fig. 9 Relationships between flexibility and emulsifying activity (A) or emulsion stability (B) of SPI under different treatment conditions

如圖9所示，相關性分析指出，在各個處理條件下SPI柔性與乳化活性和乳化穩定性呈顯著正相關關系，相關系數分別為0.945和0.936。而相關性分析指出，各個pH偏移結合熱處理條件下SPI表面疏水性與乳化活性和乳化穩定性分別呈正相關關系和顯著正相關關系，相關系數分別為0.823和0.912。

不同pH偏移處理條件下SPI結構隨柔性的變化趨勢各不相同。pH 7.0條件下，蛋白柔性隨著熱處理溫度的升高而增加，SPI表面疏水性在熱處理溫度90 ℃時顯著升高，在120 ℃又明顯下降。pH 7.0條件下，只有游離巰基含量隨熱處理溫度的升高而上升，在此條件下SPI柔性的增加可能是由于SPI分子內二硫鍵的斷裂造成的。pH 2.0偏移處理條件下隨著熱處理溫度的升高，柔性逐漸增加，SPI表面疏水性在90 ℃熱處理時顯著升高，在120 ℃時又明顯下降，游離巰基含量隨熱處理溫度升高而下降，處理溫度為90 ℃會導致SPI粒徑的降低，當處理溫度為120 ℃時SPI粒徑明顯的增大。說明聚集體的形成不會導致柔性的降低，原因可能是維系聚集體剛性結構的化學鍵與天然的SPI分子內部的化學鍵相比，化學鍵（如疏水相互作用和新生成的二硫鍵）之間的結合力更加容易受到破壞，導致蛋白對外部環境變化更加的敏感，從而聚集體也表現出較好的柔性。pH 11.0偏移處理條件下熱處理會造成柔性的增加，SPI表面疏水性在90 ℃熱處理時顯著升高，在120 ℃時又明顯下降。游離巰基濃度隨熱處理溫度升高而下降。熱處理90 ℃和120 ℃會導致SPI粒徑的降低，內源性色氨酸熒光光譜的結果表明SPI亞基發生了解離。在此條件下SPI柔性的增加可能是由于SPI分子解離造成的。

3 結 論

在各個pH偏移處理條件下，SPI柔性隨著處理溫度的升高而增加。相比于pH 7.0條件，pH 2.0和pH 11.0偏移處理促進了SPI在加熱過程中柔性的增加，其中pH 11.0條件下熱處理對柔性影響更加強烈。

pH 7.0條件下，游離巰基含量隨熱處理溫度的升高而增加，SPI柔性的增加與SPI內二硫鍵的斷裂有關。pH 11.0偏移處理條件下，SPI在加熱過程中發生了解離，SPI柔性增加。紫外掃描、內源性色氨酸熒光光譜研究發現隨著柔性的增加，SPI結構變的更加舒展。

在實驗條件下，SPI柔性與乳化活性和乳化穩定性呈顯著正相關，相關系數分別為0.945和0.936。