麥芽糖漿糖基化改性玉米醇溶蛋白及在膠囊殼中的應用

張慧君，陳又銘，辛德慧，沙迪昕，王文霞，姜寧寧，郭 浩，張慧敏

（齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

傳統的食用藥用膠囊是以動物的骨頭、皮和結締組織為原料，經一系列復雜的理化處理后制得的高蛋白、無脂肪、易被人體吸收的明膠制品。然而該膠囊存在易失水硬化、吸水軟化，在貯藏過程中對濕、氧敏感藥物保護作用差，與醛類物質易發生交聯反應，膠囊殼有崩解延遲及藥物溶出度降低等缺陷[1-2]。另外，由于動物疫情（瘋牛病）近年來的頻繁爆發，牛源性的明膠膠囊被禁用[3-4]。而且明膠制得的膠囊成本較高使得一些不法廠商使用重金屬鉻超標的工業明膠冒充食用明膠來生產藥用膠囊。因此，由于全球動物資源有限，引起了人們對膠囊壁材料的關注，在醫藥和食品工業中植物膠囊替代明膠膠囊已經成為發展趨勢。

玉米黃粉是玉米濕法生產淀粉的副產物，玉米醇溶蛋白是玉米黃粉的主要成分。由于其蛋白分子中存在大量的疏水氨基酸和含硫氨基酸，缺少帶電的極性氨基酸，這些氨基酸分子間常以二硫鍵、疏水鍵和氫鍵連接在一起，具有良好的成膜特性[5-6]。玉米醇溶蛋白可在無需添加鞣制劑的條件下制成具有較強阻濕、阻氧以及腸溶性的可食性薄膜[7]。這種優良的成膜特性加上原料的綠色可食性，使得玉米醇溶蛋白膜成為近年來人們研究的熱點。然而這種膜材質較脆，機械力學穩定性差，不能滿足作為包裝材料（如食用或藥用膠囊）的力學強度以及產品貨架期的要求，不能真正意義用于實際生產[8-9]。

加入塑化劑是一種提高膜機械性能的蛋白質?；男缘某Ｓ梅椒╗10-15]，酰化改性是蛋白質的親核基團如氨基、羥基與酰化試劑的親電基團的反應[16-17]。由于?；噭┐蠖酁榛瘜W增塑劑，因此作為食用藥用膠囊存在安全隱患。也有研究表明，蛋白質琥珀酰化程度提高，會干擾蛋白質生物利用率，有礙消化吸收[18]。

基于美拉德反應的蛋白質糖基化是指還原糖中的羰基與蛋白質的α-或ε-氨基共價連接而形成糖基化蛋白的過程[19]，糖的引入可改善蛋白質的功能性質，如提高溶解性、抗氧化性和機械強度等[20-22]。糖基化反應中的氨基酸來源有3 個，有自由氨基酸、蛋白質或多肽的N端胺以及蛋白質中的賴氨酸和精氨酸[23]。羰基供體選擇可食用的、具有還原能力的單糖、低聚糖或多糖，將反應控制在反應初期和中期階段，保證了產品的安全性。

賴氨酸是玉米醇溶蛋白糖基化反應的有效接枝位點[24]，本研究通過氨基酸分析結果確定提取玉米醇溶蛋白的溶劑。選擇淀粉糖的主要產品麥芽糖漿作為糖基化反應還原糖供體，它是通過α-1,4糖苷鍵將2 個單位葡萄糖連接在一起的雙糖?？疾煊衩状既艿鞍缀望溠刻菨{糖基化改性后玉米醇溶蛋白的機械性能并制備植物蛋白的膠囊殼，為玉米深加工提供一條新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米黃粉 黑龍江省鏡泊湖農業開發股份有限公司；麥芽糖漿 中糧公主嶺生化能源有限公司；低分子質量標準蛋白（14.1～29 kDa）辣根過氧化物酶、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上海藍季科技發展有限公司；三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxymethyl)aminomethane，Tris） 上海生工生物工程股份有限公司；甲叉雙丙烯酰胺（分析純） 德國默克集團；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）（化學純） 天津光復精細化工研究所；無水乙醇（分析純） 天津市東麗區天大化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

QTS-25質構儀 美國博樂飛公司；Q-20DSC差示掃描量熱儀 美國TA公司；s-3400掃描電子顯微鏡、L-8800氨基酸分析儀 日本日立公司；WSL-1000D超聲波信號發生器 南京順流儀器有限公司；LYOQUEST-85真空冷凍干燥機 西班牙泰士達公司；Thermo702超低溫冰箱 賽默飛世爾科技有限公司；ECP3000三恒多用電泳儀 北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

取適量玉米黃粉，經酶法除淀粉、丙酮脫色后的樣品，用不同體積分數乙醇溶液浸提2 h，5 000 r/min離心15 min，取上清液，勻速倒入5 倍浸提液體積的0 ℃冰水，攪拌，滴加1 mol/L NaOH溶液調pH 6左右，出現白色沉淀，經5 000 r/min離心3 min，得到沉淀，水洗3 次，冷凍干燥，得到玉米醇溶蛋白樣品，備用。

1.3.2 玉米醇溶蛋白氨基酸組成分析

分別采用體積分數60%、70%、80%和95%乙醇溶液浸提去除色素以后的玉米黃粉，提取玉米醇溶蛋白。準確稱取不同體積分數乙醇溶液提取玉米醇溶蛋白0.050 0 g，在安瓿瓶中加入6.67 mol/L鹽酸9 mL，氮吹儀充氮封瓶口，置于110 ℃烘箱中24 h，酸水解后用6 mol/L NaOH溶液8.50 mL定容。調pH 2.2，用檸檬酸鈉緩沖溶液定容至100 mL，過濾，上機分析，檢測波長為280 nm，流動相流速為1.8 mL/min，柱溫為室溫。

1.3.3 玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

樣品制備：準確稱取玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿的凍干樣品，用不同體積分數乙醇溶液溶解，配制成質量濃度為3 g/L溶液，取200 μL溶液于1.00 mL離心管中與樣品緩沖溶液（0.5 mol/L Tris-HCl，pH 6.8、甘油、10% SDS、0.1%溴酚蘭、β-巰基乙醇、雙蒸水）1∶1混合，10 000 r/min離心5 min，取上清液沸水浴中煮沸5 min后冷卻備用。

電泳實驗：分別配制12%的分離膠，5%的濃縮膠。首先灌分離膠，水封，30 min后棄去水。灌濃縮膠膠，30 min后梳膠，置于電泳槽內，注入電極緩沖液。每孔進樣量為10 μL，連接電泳儀，恒壓控制，濃縮膠上所置電壓為80 V，當染料前沿進入分離膠后，電壓將提高到設定120 V，當樣品帶遷移到距離膠板底部1 cm左右，關閉電源。

玉米醇溶蛋白染色和脫色：蛋白質樣品在電泳完畢，用固定液（含12.5%三氯乙酸，30%甲醇）固定1 h，然后將膠片放入染色液（含0.1%考馬斯亮藍R-250、10%甲醇、10%冰乙酸）染色2～4 h，然后用脫色液（冰乙酸-甲醇-水，1∶1∶8，V/V）脫色3～10 h，期間更換脫色液，至背景清楚。

玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿染色（PAS染色）和脫色：用糖蛋白固定液（12.5%三氯乙酸）固定膠片15 min，雙蒸水水洗2 次，1%高碘酸氧化15 min，振蕩水洗3 次，每次5 min，在希夫試劑避光染色，30 min，用脫色液（0.5%亞硫酸鈉）振蕩水洗5 次，至條帶清晰。

1.3.4 糖基化改性及膜的制備

用70%的乙醇溶液溶解玉米醇溶蛋白，配制蛋白為8%的乙醇溶液，按一定物料比加入麥芽糖漿，調溶液的pH值，超聲波處理，70 ℃水浴條件下發生糖基化反應。反應結束后，反應產物置于70 ℃烘箱烘干成膜，取出置于30 ℃，相對濕度為43%干燥器內平衡48 h，備用。

1.3.5 蛋白膜抗拉強度測定

抗拉強度是衡量蛋白膜機械強度的一個重要指標，表示在單位面積截面上所能承受的拉力。將膜剪成4 cm×1 cm的矩形長條，置于質構儀拉伸探頭上，固定好，夾距設定為20 cm，拉伸速率為5 mm/s。按公式（1）計算抗拉強度：

式中：F為最大拉力/N；L為膜樣品的厚度/mm；在膜上均勻取10 個點，測厚儀測定其厚度，取平均值；W為膜樣品寬度/mm。

1.3.6 接枝度的測定

采用OPA法[25]測定。

試劑1：準確稱取0.040 0 g的OPA溶解在1 mL的甲醇中，再加入3 mL的蒸餾水，混勻后，將其保存于棕色試劑瓶中備用。

試劑2：稱取質量分數20%的SDS 2.5 mL，0.1 mol/L的硼砂25mL和β-巰基乙醇100 μL，最后用蒸餾水定容至50 mL。

測定時，分別移取0.3 mL試劑1和3.7 mL試劑2于試管中混勻，加入蛋白質量濃度為10 mg/mL樣品液200 μL，再次混勻后于35 ℃水浴反應2 min，在波長340 nm處測吸光度。

OPA溶液中加入200 μL賴氨酸代替樣品液為空白，二者吸光度差值為游離氨基的凈吸光度，賴氨酸作出標準曲線，y＝2.869 3x－0.001 8，r2＝0.998 9，根據凈吸光度計算樣品中游離氨基的含量。接枝度按公式（2）計算：

式中：C0為未改性前溶液中游離氨基濃度/（mol/L）；C1為改性后溶液中游離氨基的含量/（mol/L）。

1.3.7 正交試驗設計

為確定玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿的最佳成膜條件，根據單因素試驗結果分析，選取物料比、pH值、超聲功率、加熱時間進行4因素3水平的正交試驗。本研究旨在通過改性，提高蛋白質的機械性能，制備具有一定柔韌度的膠囊殼。因此，檢測指標僅定為抗拉強度一個指標（以下同），試驗設計如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table1 Coded levels and corresponding actual levels of factors used for orthogonal array design

1.3.8 膠囊殼的制備與檢測

采用70%乙醇溶液溶解玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿，制成8%左右的溶膠，70 ℃攪拌30 min制備成膠囊溶膠，備用。將涂有甘油的膠囊殼模具在烘箱70 ℃預熱、蘸膠、干燥后拔殼。

將制備空心硬膠囊殼，按照《中華人民共和國藥典》（2015版）[26]，對制備的藥用膠囊在外觀、膠囊體膠囊帽的松緊度、脆碎度、干燥質量損失、灼燒殘渣檢測。

1.4 數據處理

實驗測定均平行3 次，以 ±s表示。圖像處理采用Excel軟件，數據統計分析采用SPSS 19.0軟件，并進行Duncan多重比較。

2 結果與分析

2.1 玉米醇溶蛋白提取試劑的確定

分別采用不同體積分數的乙醇溶液提取玉米醇溶蛋白得到的氨基酸組分含量略有差異。目前玉米醇溶蛋白的提取，主要考慮總蛋白的得率，本實驗玉米醇溶蛋白的提取為后期糖基化提供氨基供體，因此應選擇賴氨酸含量高的作為提取試劑。

2.1.1 玉米醇溶蛋白氨基酸組成分析

分別采用不同體積分數乙醇溶液提取玉米醇溶蛋白，其氨基酸的組成及相對含量如表2所示。不同體積分數乙醇溶液提取的玉米醇溶蛋白，其氨基酸組成沒有差異，但氨基酸含量有差別，整體上非極性氨基酸含量較高，與文獻[27]一致。另外70%乙醇溶液提取的玉米醇溶蛋白中賴氨酸含量高于其他提取，蛋白質糖基化反應主要是蛋白質中的賴氨酸和精氨酸與糖中的羧基發生化學反應，生成酰胺化合物。因此玉米醇溶蛋白中賴氨酸和精氨酸含量高將有利于蛋白質糖基化反應的發生。本研究將重點考察體積分數60%和70%乙醇溶液提取玉米醇溶蛋白，并進行實驗。

表2 玉米醇溶蛋白氨基酸組成Table2 Amino acid composition of zein

2.1.2 玉米醇溶蛋白的SDS-PAGE分析

圖1 玉米醇溶蛋白組分電泳圖Fig.1 SDS-PAGE profiles of zein components

由圖1可知，體積分數60%、70%、80%乙醇溶液提取玉米醇溶蛋白的電泳譜帶中均出現2 條清晰條帶，且位置基本相同，分別位于22 kDa和27 kDa，說明所得組分基本一致。體積分數95%乙醇溶液提取的玉米醇溶蛋白僅在27 kDa位置出現一條細的條帶，說明體積分數95%乙醇溶液提取的玉米醇溶蛋白組分與其他乙醇溶液提取出來的組分不一樣。體積分數70%較80%乙醇溶液提取醇溶蛋白的條帶顏色較深、條帶粗，與體積分數60%、95%乙醇溶液的提取物相比，其組分的含量也高。綜合考慮，本實驗采用體積分數70%乙醇溶液提取玉米醇溶蛋白，并進行后面的實驗。

2.2 最佳改性成膜工藝確定

2.2.1 改性蛋白成膜工藝物料比的確定

圖2 不同物料比對改性后膜抗拉強度和接枝度的影響Fig.2 Effect of diff erent ratios between ingredients on tensile strength and degree of graft of films

配制質量分數8%的玉米醇溶蛋白溶液，調整pH 9的反應體系，功率400 W超聲10 min，水浴70 ℃，30 min條件下，進行糖基化反應，并制備成膜，考察不同玉米醇溶蛋白和麥芽糖漿的物料質量比（g/g）對接枝度和對膜抗拉強度的影響，如圖2所示。濕法糖基化玉米醇溶蛋白產物玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿的接枝度隨著玉米醇溶蛋白與麥芽糖漿間的物料比增加呈現先增大后減小的趨勢，當物料比7∶1時達到最高值，繼續增加物料比接枝度開始下降。當物料比小時，也就是玉米醇溶蛋白的添加相對較少，麥芽糖漿添加量相對較多，麥芽糖漿與玉米醇溶蛋白間的空間位阻增大，反應物的分子碰撞幾率減少，對其接枝反應不利。隨著玉米醇溶蛋白的添加量的逐漸增加，糖和蛋白分子的接觸幾率增加，接枝度也越來越大，當接枝度達到最高值，繼續增加物料比，接枝度開始呈現下降趨勢，可能是因為部分玉米醇溶蛋白將麥芽糖漿的作用位點包埋住，致使部分玉米醇溶蛋白的作用位點未能與麥芽糖漿發生有效的碰撞接觸，不利于糖基化反應，使糖基化反應不夠徹底。

蛋白和糖的分子間的共價鍵合是在一定的基團間進行的，為了得到具有一定抗拉強度的膜，要求采用合適的氨基與羰基供體物配比，實現最佳比例的反應[28]。由圖2可知，抗拉強度隨著玉米醇溶蛋白與麥芽糖漿間的物料比增加同樣呈現先增大后減小的趨勢，當物料比9∶1時達到最高值，繼續增加物料比，抗拉強度開始下降?？估瓘姸仍酱蟊憩F出制成的膜柔韌性越好，脆性越低。在糖基化改性過程中，由于蛋白質與小分子的還原糖發生反應，可使蛋白質分子發生一定程度的伸展，促使蛋白分子成膜時疏水基團和巰基交聯，可以增加膜的機械性能。然而當物料比11∶1，由于接枝度下降，蛋白質的交聯不夠，因此膜的機械性能改善不夠。本研究的最終目的是通過改性提高膜的機械性能，因此選擇物料比9∶1。

2.2.2 改性蛋白成膜工藝中pH值的確定

圖3 不同pH值對改性蛋白膜接枝度和抗拉強度的影響Fig.3 Effect of different pH values on tensile strength and degree of graft of films

配制質量分數8%的玉米醇溶蛋白溶液，按照玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿的物料質量比（g/g）9∶1，在功率400 W條件下超聲10 min，水浴70 ℃，30 min進行糖基化反應，考察在玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿體系中，不同pH值對接枝度與對膜抗拉強度的影響，如圖3所示。濕法糖基化體系中過高的pH值可以引發蛋白質的變性，在較低的pH值條件下，反應并不充分[29]。因為濕法糖基化反應的本質是堿催化的反應，所以在堿性條件下更有利于玉米醇溶蛋白與麥芽糖漿進行接枝反應，本研究設定的體系pH值范圍取7～11。

玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿的接枝度變化范圍均在15%～30%左右之間。玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿反應體系pH值越高，接枝度越低。在pH值達到10以后接枝度都呈下降趨勢。這是因為當反應體系的堿性過強時，氨基酸就會發生胱賴反應，產生有毒化合物，不利于玉米醇溶蛋白與麥芽糖漿接枝反應的進行[28]。

玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿膜的抗拉強度變化趨勢相同，即呈現起初隨pH值增加而增加，達到最高點又開始下降。其中玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿膜在pH 10時達到最佳的抗拉強度。

2.2.3 改性蛋白成膜工藝中超聲功率的確定

圖4 超聲功率對改性蛋白膜接枝度和抗拉強度的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic powers on tensile strength and degree of graft of films

配制質量分數8%的玉米醇溶蛋白溶液，按照物料質量比（g/g）玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿為9∶1混合，調整玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿反應體系pH 9，超聲反應10 min后，糖基化加熱70 ℃反應30 min條件下，考察不同超聲功率對接枝度與對膜抗拉強度的影響，如圖4所示。超聲功率在300～450 W之間，玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿的接枝度變化不明顯，趨于穩定。說明適當的超聲功率，一方面會提高玉米醇溶蛋白在70%乙醇溶液中的溶解性，另一方面會使游離氨基酸的含量增加，促進該反應的進行。當超聲功率增大時，在溶液中形成更高頻率的振蕩，蛋白質分子的一級空間結構受到破壞，致使肽鍵斷裂，游離氨基數量增多，導致N-末端殘基數目過度增多，自由氨基也過度增多，麥芽糖漿與賴氨酸的碰撞幾率變小，導致了玉米醇溶蛋白的接枝度下降；當超聲功率過高，會致使溶液的局部溫度過高，加劇了反應體系溶液中麥芽糖漿自身發生焦糖化的反應，體系褐變程度升高[29]。對于抗拉強度，玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿的變化趨勢與接枝度的變化趨勢類似，過高的功率不適合膜機械性能的改變，與文獻[30]一致。綜上所述，糖基化反應的最佳超聲功率是400 W。

2.2.4 改性蛋白成膜工藝中加熱時間的確定

圖5 糖基化加熱時間對改性蛋白膜接枝度和抗拉強度的影響Fig.5 Effect of different heating times on tensile strength and degree of graft of films

配制質量分數8%的玉米醇溶蛋白溶液，按照玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿的物料質量比9∶1，玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿反應體系pH 9，在超聲功率400 W條件下作用10 min以后，考察不同糖基化加熱時間對接枝度與對膜抗拉強度的影響，如圖5所示。在玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿糖基化反應過程中，其接枝度隨加熱時間的延長而增加，玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿膜的抗拉強度的變化規律隨著加熱時間的延長，呈現逐步上升的趨勢，在45～60 min趨于平穩，繼續延長反應時間，抗拉強度下降。這是因為蛋白質與多糖的反應中，隨著加熱時間的延長，蛋白質結構部分展開，多糖與蛋白質受熱逐步結合，促進蛋白質球狀分子伸展，疏水基團暴露[31]。但是隨著加熱時間的延長，一方面使糖漿中的還原性羰基與蛋白質中的賴氨酸結合，另一方面造成了蛋白質結構的伸展，增加了蛋白質分子的相互作用，導致凝聚和沉淀，成膜性下降，而且隨著時間的延長，混合樣品的顏色由淺變深。因此，在該反應條件下，玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿反應時間為45 min。

2.2.5 正交試驗設計與結果

表3 正交試驗設計及結果Table3 Orthogonal array design with analysis of experimental results

由表3可知，各因素對改性玉米醇溶蛋白膜的抗拉強度影響程度依次為pH值＞物料比＞加熱時間＞超聲功率，最佳工藝條件為物料比11∶1、pH 9、超聲功率400 W、加熱時間15 min，經驗證實驗此時，接枝度為34.96%，抗拉強度為9.22 MPa，約為未改性玉米醇溶蛋白膜（4.2 MPa）的2 倍。

2.3 玉米醇溶蛋白和玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿的SDSPAGE分析

圖6 SDS-PAGE考馬斯亮藍和糖蛋白染色圖Fig.6 SDS-PAGE profiles of the samples stained for proteins and glycosylated proteins

如圖6所示，Marker分別為14 400～97 400 Da的低分子質量標準蛋白和辣根過氧化物酶。由圖6可知，考馬斯亮藍染色測定改性后產物玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿的分子質量變化不明顯，這是因為麥芽糖漿屬于小分子糖，因此，反應后的接枝產物分子質量變化不明顯。以辣根過氧化物酶作為陽性對照，采用高碘酸希爾法與接枝物中糖分子進行顏色反應，從而檢測糖分子的存在，結果表明糖蛋白染色顯示紅色條帶，說明糖基化樣品中糖基的存在，確認玉米醇溶蛋白中導入了糖分子，證明麥芽糖漿與玉米醇溶蛋白發生了糖基化反應，生成了蛋白質和糖的交聯產物。

2.4 膠囊殼的制備

經過溶膠、蘸膠制備膠囊殼，按照《中華人民共和國藥典》（2015版）[26]，對制備的藥用膠囊在外觀、膠囊體膠囊帽的松緊度、脆碎度、干燥質量損失、灼燒殘渣檢測結果如圖7和表4所示。

圖7 制備的膠囊殼Fig.7 Visual appearance of capsule shells

表4 檢測指標Table4 Physicochemical parameters of capsule shells

由玉米醇溶蛋白和麥芽糖漿-玉米醇溶蛋白制備的2 種膠囊殼，其中玉米醇溶蛋白膠囊殼，由于脆性較大，膠囊殼從模具上退下的時候不完整，會有裂痕，外觀不合格。而玉米醇溶蛋白-麥芽糖漿制備膠囊殼的各項檢測結果都符合國家藥典標準，沒有裂縫，無漏粉現象，表面光滑，質地均勻，沒有氣泡。其松緊度、脆碎度和干燥質量損失均合格。

3 結 論

關于提高玉米醇溶蛋白膜的抗拉強度，目前文獻主要是采用添加增塑劑和交聯劑的方法，雖然提高了玉米醇溶蛋白膜的抗拉強度，但是增塑劑和交聯劑不能用于食品和藥品。本研究的膠囊殼生產原料均是食品級，無化學殘留，糖基化羰基的供給原料為麥芽糖漿，其本身也是天然甜味劑，因此可作為保健食品或藥品的膠囊殼材料。本研究證明以玉米醇溶蛋白和麥芽糖漿為原料，通過濕法糖基化改性可顯著改善玉米醇溶蛋白膜的機械性能，適合制備膠囊殼，替代明膠膠囊。

與傳統明膠膠囊殼作對照，本實驗說明采用糖基化的方式可有效地改善其機械性能，適當的交聯可提高膜的抗拉強度，該強度適合制備植物蛋白膠囊殼。