外源抗氧化劑α-生育酚在河蟹肌肉脂肪-蛋白質氧化體系中的作用

劉小莉，彭歡歡,，夏秀東，周劍忠，劉 源，趙江濤,*

（1.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306）

淡水水產品肉質細嫩，營養豐富，不易保鮮和貯藏。凍藏是保存水產品的有效方法，但也不可避免地造成品質下降。這是由于水產品中含有大量高度不飽和脂肪酸和蛋白質，即使在低溫條件下也會氧化變質[1]。越來越多的研究表明，脂肪在氧化的過程中會產生大量的自由基和活性次生氧化產物，進一步與蛋白質形成共價結合，從而誘導蛋白質聚合反應[2-3]。一方面，脂肪過氧化初級產物裂解產生脂質自由基，自由基通過氫反應充當印發劑使蛋白質分子變成自由基，蛋白質自由基又引發聚合式鏈反應最終導致蛋白質聚合[4]。另外，脂質氧化的次生產物，即醛類或酮類化合物的羰基能夠與蛋白分子中的氨基側鏈基團反應，使多肽鏈發生鏈內或鏈間交聯現象[5]。蛋白質進一步通過氫鍵、疏水鍵和二硫鍵等的作用進行重排，形成高分子的蛋白質聚合物，從而改變水產品的組織、顏色、水合能力和風味等一系列營養特性。

Laurizsen等[6]研究表明魚類產品在冷凍貯存過程中脂肪會發生氧化，氧化產物使魚肉質構發生變化，如組織蛋白變硬、聚集。此外，脂肪氧化還會使部分氨基酸，如組氨酸、賴氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸損失，并損害其他色素蛋白質，如細胞色素C和血紅蛋白。Park等[7-8]比較了3 種模擬體系中豬肉肌原纖維蛋白的變化，發現在不同的氧化體系條件下肌原纖維蛋白發生不同程度的變化，主要表現為羰基的形成，蛋白熱穩定性下降以及蛋白交聯聚集等。Faustman等[9]發現脂肪氧化的初級產物和次級產物對于蛋白質氧化起促進作用，脂溶性抗氧化劑α-生育酚能夠有效抑制脂肪氧化，亦可有效抑制水溶性蛋白的氧化。

河蟹是我國傳統特色的經濟蟹類，但上市時間比較集中，大部分以鮮活河蟹進行銷售，很容易造成供大于求而滯銷的局面，特別是小規格蟹價格低，嚴重影響了河蟹產業經濟效益的提高[10]。因此有必要進行河蟹精深加工的研究，其中原料的貯藏問題是河蟹加工產業的瓶頸問題。然而目前對凍藏過程中河蟹肌肉脂肪氧化導致蛋白質變性方面的研究鮮見報道。α-生育酚是一種天然抗氧化物質，無毒性，目前廣泛應用于多種食品的抗氧化研究[11]。本實驗建立河蟹氧化脂肪-蛋白質的模擬體系，探討氧化脂肪所引起的蛋白質特性的改變，以及α-生育酚對氧化脂肪誘導蛋白質發生變性的抑制作用，并以此為指導，控制脂肪氧化而減少蛋白質變性，為提高食品品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活公河蟹由常熟市金唐市水產有限公司提供，體質量（150±15）g，江蘇省淡水水產研究所鑒定為中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis H. Milne-Edwards）。

α-生育酚、抗壞血酸（食品級） 鄭州思源食品添加劑有限公司；5,5’-二硫代雙-硝基苯甲酸 美國Sigma公司；BCA法蛋白定量測試盒、丙二醛測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；過硫酸銨（ammonium persulphate，APS）、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（tetramethylethylenediamine，TEMED）、預混合分離膠、預混合濃縮膠、5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液、快速蛋白染色液 新賽美生物科技有限公司；石油醚、氫氧化鉀、甲醇、三氟化硼、乙醚、氯化鈉、正己烷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三羥甲基氨基甲烷（2-amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol，Tris）、氯化鉀、溴酚藍均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

VK-6001絞肉機 德國歐諾華公司；RE-6000旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；T25勻質分散機 德國IKA公司；TSQ 800 Evo氣相色譜-質譜聯用儀 賽默飛世爾科技公司；DHG-9146A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司；3K15高速離心機 北京五洲東方科技發展有限公司；UV-1600PC紫外分光光度計上海美譜達儀器有限公司；SynergyH1酶標儀 美國柏騰儀器有限公司；GS-800垂直電泳槽 美國Bio-Rad公司；150型河蟹采肉機 山東省諸城市興和機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蟹肉采集及預處理

采用河蟹采肉機，通過擠壓方式采集蟹肉，-20 ℃保存備用。

1.3.2 脂質的提取及氧化指標測定

采用Folch等[1]的方法提取蟹油。制備的蟹肉用20 倍體積的石油醚（沸程60～90 ℃）混合，室溫振搖40～60 min，收集有機溶劑相。下層水相樣品再加入有機溶劑提取2 次。合并有機相，40 ℃旋轉蒸發揮干有機溶劑，得到粗蟹油，待用。按照GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛生標準的分析方法》中第二法所述測定過氧化值。依據硫代巴比妥酸法原理采用試劑盒檢測丙二醛含量，結果以1 mg樣品蛋白質中丙二醛含量（nmol/mg）表示。

1.3.3 氣相色譜-質譜聯用分析脂肪酸組成

參照Liu Wei等[13]的方法對油脂進行甲酯化處理。取所得蟹油0.2 mL，加入2 mL體積分數為5%的氫氧化鉀-甲醇溶液，75 ℃水浴15 min，冷卻后加入2 mL體積分數為14%的三氟化硼乙醚-甲醇溶液，75 ℃水浴2 min，加入飽和氯化鈉溶液2 mL和正己烷1 mL，混勻后靜置，取上清液，采用氣相色譜-質譜聯用法檢測蟹油脂肪酸組成。

色譜條件：SLB-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：120 ℃保持6 min，以3 ℃/min升溫到250 ℃，保持25 min；載氣（He）流速1.2 mL/min，壓力2.4 kPa，進樣量1.0 μL；分流比30∶1。

質譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；燈絲發射電流200 μA；離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；檢測器電壓350 V；質量掃描范圍m/z 33～800。

1.3.4 模擬反應體系建立

將提取的油脂于90 ℃烘箱中分別放置12 h和24 h，得到氧化型蟹油。取未被氧化、氧化12 h、氧化24 h的蟹油各10 mL，分別加入到100 g蟹肉中，用勻漿機攪拌均勻，得到3 組蟹油-蛋白質模擬體系（編號I、II、III）。將上述3 組模擬體系各分為2 份，其中一組分別加入0.015%的α-生育酚和0.02%的抗壞血酸（編號IV、V、VI）。共6 組處理進行實驗。將6 組樣品置于常溫條件下1周，定期取樣進行蛋白質氧化指標的測定。

1.3.5 肌原纖維蛋白的提取

參照Fang Yang等[14]的方法進行不同處理的樣品中肌原纖維蛋白的提取。稱取5 g蟹肉樣品加10 mL、4 ℃預冷的去離子水，12 000 r/min勻漿30 s，10 000 r/min、4 ℃離心20 min，棄去上清液，沉淀中加入去離子水，再重復提取1 次。沉淀中再加入20 mL、4 ℃預冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）（其中補充0.6 mol/L的NaCl），12 000 r/min勻漿30 s，10 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清液。沉淀用上述步驟再重復提取1 次，合并上清即為肌原纖維蛋白粗提取液，其濃度采用BCA試劑盒測定。

1.3.6 活性巰基的測定

參照Benjakul等[2]的方法進行測定。1.3.5節中提取的蛋白溶液0.5 mL，加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 6.8）。取該混合液1 mL，加入0.1 mL 0.1% 5,5’-二硫代雙-硝基苯甲酸，40 ℃溫育25 min，測定波長412 nm處的吸光度。空白樣用0.6 mol/L KCl（pH 7.0）代替樣品。活性巰基含量以1 mg蛋白質中活性巰基的物質的量計，按公式（1）計算：

式中：A為412 nm波長處的吸光度；n為稀釋倍數；ε為摩爾吸光系數13 600/（L/（mol·cm））；p為蛋白質質量濃度/（mg/mL）；b為吸光池光程（1 cm）。

1.3.7 表面疏水性的測定

參考Chelh等[3]的方法，并稍作修改。將提取的肌原纖維蛋白溶液質量濃度調整為1 mg/mL，取1 mL加入40 μL1 mg/mL的溴酚藍溶液，空白對照為1 mL提取緩沖液加入40 μL1 mg/mL的溴酚藍溶液，渦旋振蕩混勻10 min，于4 ℃、4 000×g離心15 min，取上清液稀釋10 倍后在波長595 nm處測定吸光度。表面疏水性按公式（2）計算：

式中：S為表面疏水性/μg；Acontrol為空白的吸光度；Asample為樣品的吸光度；40為系數。

1.3.8 SDS-PAGE檢測

取10 mL的8%預混合分離膠加入100 μL 10% APS和5 μL TEMED，混勻后灌入制膠板內，加入適量的醇或水壓平分離膠，待20～30 min后凝聚成分離膠。取5 mL的預混合濃縮膠加入50 μL 10% APS和5 μL TEMED，混勻后灌入制膠板內，緩慢插入梳子，待20～30 min后凝聚即為濃縮膠。取12 μL的蛋白上樣液進行電泳，全程150 V，待溴酚藍到達底部，即可完成電泳。結束后，用去離子水洗滌3 次，每次約5 min，再加入約20 mL快速蛋白染色液過夜，用去離子水脫色1 h后成像拍照。

1.3.9 傅里葉變換紅外光譜的測定

將提取的肌原纖維蛋白溶液放入真空冷凍干燥機中干燥得到粉末。將樣品粉末均勻地鋪滿在采樣器上，進行紅外光譜掃描，掃描次數256，分辨率為4 cm-1。

1.4 數據處理

本實驗數據為3 次重復的平均值。采用SPSS 13.0軟件進行數據統計和方差顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 蟹油氧化指標及脂肪酸組成

過氧化值和丙二醛是常用的脂質氧化評價指標，本研究中新鮮蟹油的過氧化值和丙二醛含量分別為（3.61±0.26） meq/kg、（11.64±1.26） nmol/mg，氧化12、24 h后過氧化值分別達到（5.50±0.47） meq/kg和（8.26±0.21） meq/kg，丙二醛含量分別達到（16.51±0.87） nmol/mg和（29.86±0.73） nmol/mg，可見在高溫條件下，蟹油快速發生氧化，導致酸敗。由表1可以看出，新鮮的蟹油飽和脂肪酸相對含量為15.21%，氧化12、24 h后分別達到29.83%、44.85%。蟹油脂肪酸中油酸相對含量最高，高溫氧化后，油酸相對含量顯著下降，分別僅為57.01%、43.87%。由于油脂在氧化過程中，自由基會連鎖攻擊不飽和脂肪酸，從而使得不飽和脂肪酸發生衰敗，蟹油中不飽和脂肪酸總量會隨氧化時間的延長呈下降趨勢，相應飽和脂肪酸的含量升高。其他學者也報道過類似的研究結果[17]。研究表明，脂肪氧化與蛋白質氧化之間是相互關聯的，且兩者中的任一種物質氧化產生的化合物都會促進另一種物質的氧化[18-19]。脂肪氧化形成的羥自由基可以奪取蛋白質分子的氫離子，使得蛋白質發生與脂肪氧化類似的自由基鏈式反應[20-21]。

表1 新鮮與氧化蟹油中脂肪酸相對含量Table1 Contents of fatty acids in fresh and oxidized crab oils%

2.2 活性巰基含量的變化

圖1 肌原纖維蛋白中巰基含量的變化Fig.1 Changes in active sulfhydryl content of myofibrillar protein

活性巰基含量的變化能夠反映出蛋白質變性集合的程度，活性巰基含量下降的主要原因是巰基氧化形成二硫鍵所致[22]。由圖1可以看出，6 組樣品在貯藏期間活性巰基含量都不斷減少。未加抗氧化劑的3 組對比發現，添加氧化蟹油，下降速度越快，這可能是經人工氧化的蟹油產生大量的自由基，進而誘導肌原纖維蛋白分子發生變性和蛋白質結構改變，而使得隱藏的分子內部的巰基活性基團暴露出來，巰基易于氧化形成二硫鍵，導致活性巰基含量的不斷下降。添加抗氧化劑的活性巰基減少量低于未加抗氧化劑組，由于α-生育酚屬于酚類物質使得羥基釋放活潑氫，與自由基的結合會抑制其對脂質的攻擊。由此可以看出，α-生育酚對巰基具有一定的保護作用，從而抑制了蛋白質分子的交聯、聚合現象的發生。

2.3 表面疏水性的變化

脂質氧化還可能引起蛋白質分子內部結構和性質發生改變。其中表面疏水性是與外界極性水環境相連的蛋白質表面疏水性基團數量的一個重要標志[23]。蛋白質在降解發生變性的過程中，隱藏在蛋白質內部的分子暴露出來，改變其疏水性，導致疏水性基團的增加，因此蛋白質表面疏水性可以在一定程度上衡量蛋白質的變性程度。當蛋白質分子空間結構發生變化時，分子內部的疏水基團和親水基團相對位置也會發生改變，導致表面疏水性指數發生變化[24-25]。

圖2 肌原纖維蛋白中表面疏水性的變化Fig.2 Changes in surface hydrophobicity of myofibrillar protein

由圖2可以看出，在貯藏過程中，隨著蟹油氧化程度的增加，肌原纖維蛋白的表面疏水性顯著升高（P＜0.05），可能是蛋白質分子折疊，使肽鏈斷裂或結構伸展，分子的內部疏水基團暴露導致表面疏水性的增加。說明油脂的氧化在一定程度上可以促使肌原纖維蛋白疏水基團的暴露，這與章銀良等[26]的研究結果一致。添加α-生育酚的樣品，表面疏水性都較相應的未添加α-生育酚的對照樣品模擬體系少。α-生育酚抗氧化作用的機制主要是因為α-生育酚可以首先替代其他的物質被氧化，從而延緩不飽和脂肪酸的氧化作用，且以抗壞血酸為增效劑，可以提高其抗氧化效能[27-28]。在貯藏初期，表面疏水性隨著時間延長不斷提高，從而誘導蛋白質表面疏水性不斷增大，當反應到后期脂肪氧化趨于飽和。α-生育酚可以抑制微生物的生長，延緩蛋白質的降解作用及蛋白變性，進而延緩表面疏水性的增加；而且α-生育酚可能抑制了脂肪氧化體系對蛋白質折疊的作用，而延緩表面疏水性的增加。

2.4 SDS-PAGE結果

圖3 河蟹肌肉肌原纖維蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE profiles of myofibrillar protein

由圖3可以看出，條帶從上到下分別是肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈，其中肌球蛋白重鏈和肌動蛋白是主要的蛋白質條帶[29]。6 組樣品的肌原纖維蛋白條帶隨著貯藏時間延長，發生不同程度的變淡。貯藏1 d后蟹肉肌原纖維蛋白條帶清晰，可以清楚的辨別蛋白中的肌球蛋白重鏈、肌動蛋白、原肌球蛋白和肌球蛋白輕鏈。蛋白質在貯藏3 d后，肌球蛋白重鏈條帶明顯減弱，且氧化程度越高，條帶減弱程度越明顯，添加抗氧化劑的3 組IV、V、VI較相對應的未添加抗氧化劑3 組I、II、III條帶降解相對緩慢，但Gel Image System軟件對條帶光密度分析結果顯示，除了貯藏1 d后的V、II組肌球蛋白重鏈、肌動蛋白存在顯著差異，其他組間條帶差異不顯著。貯藏結束后，幾乎所有蛋白質條帶變淺消失。結合2.2節和2.3節結果，貯藏過程中不同處理組間活性巰基含量和表面疏水性指標差異顯著，可見SDS-PAGE用于檢測蛋白質氧化程度不及活性巰基和表面疏水性指標靈敏。

2.5 傅里葉變換紅外光譜測定

將肌原纖維蛋白溶液冷凍干燥，利用傅里葉變換紅外光譜儀進行光譜掃描，選擇波數1 600～1 700 cm-1范圍經Peakfit 4.12軟件分析得到自動去卷積后的蛋白質二級結構。在蛋白質的二級結構中，α-螺旋結構是蛋白質分子的有序結構，具有高度的結構穩定性；而β-轉角和無規卷曲為蛋白質分子的無序結構，因此可將α-螺旋結構的相對含量用于判斷蛋白質結構的穩定性[30-31]。如表2所示，蟹肉與氧化12 h的蟹油混合，貯藏期結束后蛋白質β-轉角相對含量顯著增加，其他二級結構沒有顯著差異；氧化24 h后的蟹油則對蟹肉中蛋白質二級結構影響顯著，與對照相比，除了無序結構外其他結構均有顯著變化，α-螺旋和β-折疊相對含量顯著減少，β-轉角相對含量顯著增加。本研究中添加0.015% α-生育酚和0.02%抗壞血酸的抗氧化劑處理組，很好地維持了蟹肉中蛋白質的二級結構穩定，與對照相比只有氧化24 h蟹油組的β-轉角相對含量顯著增加，其他二級結構無顯著差異，說明添加抗氧化劑能很好地維持蟹肉蛋白質的二級結構穩定。

表2 貯藏結束后不同樣品中蛋白質二級結構相對含量Table2 Protein secondary structures in diff erent samples after storage%

3 結 論

河蟹肌肉蟹油經過高溫氧化后，脂肪酸組成發生變化，不飽和脂肪酸相對含量明顯下降。在氧化蟹油的作用下，河蟹肌肉蛋白質中活性巰基含量下降，表面疏水性上升，且油脂氧化程度越高，所引起的蛋白質變性越顯著。添加抗氧化劑的處理組對巰基具有保護作用，且減少表面疏水值的增加；SDS-PAGE結果顯示，隨著貯藏時間的延長，氧化程度越高，條帶減弱程度越明顯，添加抗氧化劑的3 組IV、V、VI較相對應的未添加抗氧化劑3 組I、II、III條帶降解相對緩慢，但效果并不顯著，說明SDS-PAGE法用于判定蛋白質氧化不及活性巰基和表面疏水性指標靈敏。傅里葉變換紅外光譜結果顯示，油脂氧化程度越高，相應的處理組蛋白質二級結構中α-螺旋、β-折疊相對含量越少，β-轉角則越多，添加抗氧化劑能維持蟹肉蛋白質相對穩定的二級結構。