α-L-鼠李糖苷酶以催化活性包涵體形式異源表達及其酶學性質

李彬春，張 甜，吉亞茹，李艷琴，丁國斌

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

α-L-鼠李糖苷酶（EC. 3.2.1.40）作為一類糖苷水解酶，特異性水解切割天然糖苷產物末端的α-L-鼠李糖基，如黃酮糖苷蘆丁、曲克蘆丁、柚皮苷、橙皮苷、槲皮苷和地奧司明，人參皂苷Re和Rg2、萜烯糖苷以及其他含有末端α-L-鼠李糖基的天然糖苷化合物[1-2]。α-L-鼠李糖苷酶因其眾多生物催化應用已成為一類生物技術重要酶，如柑橘類果汁脫苦味[3-4]、酶法制備異槲皮素[5-8]、由柚子皮或柚皮苷酶法制備櫻桃苷[4,9]、酶法改善天然黃酮糖苷的生物利用率[10]與生物學活性[11-13]，以及酶法制備人參皂苷Rd[14]；此外，可利用α-L-鼠李糖苷酶水解作用的逆反應酶法合成天然α-L-鼠李糖苷[15-16]。

基于氨基酸序列同源性，α-L-鼠李糖苷酶分布于糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH）家族GH28、GH78和GH106（CAZy數據庫[17]），其中以GH78家族α-L-鼠李糖苷酶的研究最為透徹，迄今為止，共有26 個GH78家族α-L-鼠李糖苷酶基因被克隆，均來源于微生物，其中18 個來自細菌，主要類屬于乳酸細菌，僅4 個晶體結構被解析，結構域組成差異很大，其中來源于Streptomyces avermitilis MA-4680的SaRha78A由6個結構域組成，包括一個催化結構域和一個碳水化合物結合結構域（carbohydrate binding module，CBM）67[18]，而來源于Klebsiella oxytoca的KoRha僅包括2個結構域，且無CBM67[19]。GH78家族α-L-鼠李糖苷酶的催化結構域是典型的（α/α）6結構，采用翻轉型催化機制，催化殘基為廣義酸堿對，催化廣義酸堿對已通過定點突變[18,20]或復合體結構分析[19]被確定，為谷氨酸與谷氨酸或天冬氨酸與谷氨酸。

利用原核系統表達外源重組蛋白的瓶頸是目的蛋白多以包涵體形式存在，過去一直認為包涵體是錯誤折疊、無生物活性的蛋白質，需經過變復性過程方可獲得可溶性生物活性蛋白[21]。然而，近年來越來越多的研究發現一些酶蛋白在特定條件下可以一種催化活性包涵體的形式表達[22-25]，催化活性包涵體具有眾多優點，正逐漸引起研究人員的關注，首先，催化活性包涵體表達量大，生產過程簡捷且費用低[26]；其次，催化活性包涵體代表了一種全新、無載體、無細胞、可降解的固定化策略[27-28]，創新性將酶蛋白表達過程與酶固定化過程有機結合起來，直接作為生物催化劑且可多次重復使用；再者，包涵體直徑一般為50～500 nm，屬于納微級材料，催化活性包涵體可作為一種納米生物催化機器。因此，催化活性包涵體作為一種全新的酶異源表達策略，具有很好的工業應用前景。

本研究以土壤細菌解肝磷脂土地桿菌（Pedobacter heparinus）作為研究材料，擬通過基因組挖掘策略利用直接克隆法獲得具有新穎酶學特性的全新α-L-鼠李糖苷酶資源，以期應用于天然黃酮糖苷生物轉化研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質粒

解肝磷脂土地桿菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌種保藏號1.2820；宿主菌大腸桿菌Trans-1-Blue和BL21（DE3）購自北京全式金生物技術有限公司；載體pET-28a為本實驗室保存。

1.1.2 培養基

2×YT培養基：胰蛋白胨16 g，酵母提取物10 g，氯化鈉5 g，加蒸餾水至1 L。

1.1.3 試劑

快速限制性內切酶NdeI與XhoI、T4 DNA連接酶與DNA分子質量標準（DL5000 DNA Marker） 寶生物工程（大連）有限公司；DNA聚合酶TransStart?FastPfu Fly DNA Polymerase 北京全式金生物技術有限公司；對硝基苯酚-α-L-吡喃鼠李糖苷（p-nitrophenol-α-L-rhamnopyranoside，PNPR） 美國Sigma公司；基因上下游引物、蛋白質分子質量標準（15～150 kDa雙色預染蛋白Marker）以及其他化學試劑 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

ZWY-2102C立式雙層全溫振蕩器、ZXGP-B2050電熱恒溫箱 上海智城分析儀器制造有限公司；YT-CJ-1ND超凈工作臺 北京亞泰科隆儀器技術有限公司；PTC-200梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；SCIENTZ-IID超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；CR22G臺式高速冷凍離心機日本日立公司；UV-5800PC紫外-可見分光光度計

上海元析儀器有限公司；水平電泳槽、垂直電泳槽、電泳儀 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設計

根據解肝磷脂土地桿菌的α-L-鼠李糖苷酶基因PhRha78E（Phep2773，GenBank數據庫序列號：ACU04972）和PhRha78G（Phep3887，GenBank數據庫序列號：ACU06078）核苷酸序列設計特異性上下游引物（表1）。

表1 α-L-鼠李糖苷酶基因PCR擴增的上下游引物Table1 Primers used for PCR ampli fi cation of α-L-rhamnosidase genes

1.3.2 α-L-鼠李糖苷酶的基因克隆

以溶于無菌雙蒸水的解肝磷脂土地桿菌菌粉作為模板，利用DNA聚合酶TransStart?FastPfu Fly DNA Polymerase進行PCR，PCR擴增條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增出目的基因后，利用Axygen PCR產物清潔試劑盒對目的產物進行回收。

回收的目的基因經NdeI和XhoI雙酶切后，與同樣經NdeI和XhoI雙酶切的載體pET-28a，利用T4 DNA連接酶連接后轉化大腸桿菌Trans-1-Blue，菌落PCR鑒定成功連接于pET-28a，菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.3 α-L-鼠李糖苷酶的異源表達

利用質粒小提試劑盒提取經測序驗證基因核苷酸序列正確的重組質粒，轉化大腸桿菌BL21（DE3）。種子液培養，挑克隆于5 mL 2×YT培養基中，卡那霉素終質量濃度50 mg/L，37 ℃、200 r/min培養7 h，種子液（體積分數1%）接種于含1 L 2×YT培養基三角瓶中（卡那霉素50 mg/L），37 ℃、200 r/min培養至菌密度OD600nm0.8～1.0時，加入終濃度0.5 mmol/L異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG）后16 ℃、200 r/min誘導表達過夜。次日8 000 r/min、4 ℃離心收集菌體，菌體稱質量，菌體經pH 8.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（1∶12（g/mL））重懸后超聲破碎，13 000 r/min、4 ℃離心30 min，沉淀稱質量，分別取上清液和沉淀重懸液進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），檢測α-L-鼠李糖苷酶的表達情況。

1.3.4 催化活性包涵體酶液的制備

超聲破碎離心后的沉淀經pH 8.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液重懸，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，去上清液，沉淀保存于-20 ℃冰箱。使用時，沉淀稱質量后利用pH 8.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液重懸至所需蛋白質量濃度的酶溶液即為催化活性包涵體酶液。

1.3.5 α-L-鼠李糖苷酶活力的測定

α-L-鼠李糖苷酶的催化活性通過利用紫外-可見分光光度計檢測對硝基苯酚釋放量來測定，標準反應體系為500 μL，470 μL 50 mmol/L反應緩沖液中加入10 μL PNPR（10 mmol/L，ddH2O溶解），反應溫度下金屬浴保溫2 min，立即加入20 μL包涵體酶液（PhRha78E 20 mg/mL，PhRha78G 50 mg/mL）反應5 min，之后加入500 μL1 mol/L Na2CO3溶液終止反應，測定405 nm波長下吸光度變化值，酶活力按照文獻[29]計算，酶活力定義：在最適反應條件下，每分鐘釋放1 μmol對硝基苯酚所需酶量為1 個酶活力單位（U）。每個反應做3 個平行。

1.3.6 α-L-鼠李糖苷酶的酶學性質測定

1.3.6.1 最適反應pH值測定

測定α-L-鼠李糖苷酶PhRha78E在50 ℃分別于50 mmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液（pH 3.9～5.8）、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 6.0～8.0）、Tris-HCl緩沖液（pH 8.0～8.6）、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 8.6～9.0）中的活力；測定α-L-鼠李糖苷酶PhRha78G在40 ℃分別于50 mmol/L檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液（pH 4.9～5.7）、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液（pH 6.0～8.0）、Tris-HCl緩沖液（pH 8.0～8.6）、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 8.6～9.0）中的活力。

1.3.6.2 最適反應溫度測定

測定α-L-鼠李糖苷酶PhRha78E于50 mmol/L pH 6.5 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中在20～80 ℃的活力；測定α-L-鼠李糖苷酶PhRha78G于50 mmol/L pH 7.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中在10～60 ℃的活力。

1.3.6.3 酶動力學常數測定

測定α-L-鼠李糖苷酶PhRha78E在60 ℃于50 mmol/L pH 6.5 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中對不同濃度（0.048～2.4 mmol/L）PNPR的活力，蛋白質量濃度為20 mg/mL，反應時間為1 min；測定α-L-鼠李糖苷酶PhRha78G在40 ℃于50 mmol/L pH 7.0 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液中對不同濃度（0.048～2.4 mmol/L）PNPR的活力，蛋白質量濃度為30 mg/mL，反應時間為1 min。

利用軟件GraphPad 6.0基于Michaelis-Menten公式對不同底物濃度及其對應酶活力進行非線性擬合獲得米氏常數Vmax與Km，根據公式kcat=Vmax/[E]計算獲得轉換數kcat，從而計算催化效率kcat/Km。

2 結果與分析

2.1 α-L-鼠李糖苷酶基因的擴增

基因組信息挖掘揭示解肝磷脂土地桿菌的基因組（GenBank序列號：CP001681）[30]含有大量糖苷水解酶基因，其中含有10 個GH78家族α-L-鼠李糖苷酶基因，對其中兩個基因Phep2773和Phep3887進行研究，分別命名為PhRha78E和PhRha78G。以解肝磷脂土地桿菌基因組為模板，進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳顯示獲得大小分別約為2 200 bp和2 700 bp的單一條帶，結果如圖1所示，與目的基因大小相符，擴增得到目的基因。

圖1 α-L-鼠李糖苷酶基因的PCR擴增結果Fig.1 PCR ampli fi cation of α-L-rhamnosidase genes

2.2 α-L-鼠李糖苷酶基因重組表達質粒的鑒定

圖2 α-L-鼠李糖苷酶基因重組質粒構建的菌落PCR鑒定結果Fig.2 PCR ampli fi cation for identi fi cation of α-L-rhamnosidase genes ligated into the vector pET-28a

以轉化后的菌斑作為模板，pET-28a通用引物T7和T7-ter為引物，PCR擴增，菌落PCR結果如圖2所示，PhRha78E的陽性克隆在大小約2 400 bp處存在單一條帶，顯示其5 個克隆中3 個為陽性克隆，PhRha78G的陽性克隆在大小約2 900 bp處存在單一條帶，顯示其5 個克隆中4 個為陽性克隆。分別選擇兩個陽性克隆送去測序，測序結果顯示插入表達載體pET-28a的目的基因核苷酸序列與其理論序列一致，表明重組質粒正確插入了目的基因，成功構建了重組表達質粒pET-28a-PhRha78E和pET-28a-PhRha78G。

2.3 α-L-鼠李糖苷酶以催化活性包涵體形式異源表達

將重組質粒pET-28a-PhRha78E和pET-28a-PhRha78G分別轉化大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組菌株并進行誘導表達，菌體超聲波破碎低溫高速離心后，取上清液和沉淀樣品進行SDS-PAGE分析，圖3顯示在目的酶理論分子質量大小處（PhRha78E，86 kDa和PhRha78G，103 kDa）存在蛋白條帶，二者僅少量以可溶性形式表達于上清液，大部分以包涵體形式存在于沉淀。

圖3 α-L-鼠李糖苷酶重組蛋白質的SDS-PAGE圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant proteins of α-L-rhamnosidases

將含有目的酶包涵體的沉淀用pH 8.0的50 mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液重懸，探測目的酶包涵體能否催化水解底物PNPR，利用紫外-可見分光光度計檢測405 nm波長處產物對硝基苯酚的吸光度變化，顯示目的酶包涵體可以催化水解PNPR，具有α-L-鼠李糖苷酶活性，表明目的酶PhRha78E和PhRha78G在大腸桿菌中以催化活性包涵體形式表達，每克菌體可分別獲得0.42 g和0.39 g含目的酶催化活性包涵體的沉淀（表2）。

表2 α-L-鼠李糖苷酶催化活性包涵體的收率Table2 Production of α-L-rhamnosidases as catalytically active inclusion bodies

2.4 α-L-鼠李糖苷酶催化活性包涵體的酶學性質

圖4 pH值對PhRha78E（A）和PhRha78G（B）酶活力的影響Fig.4 Effects of pH on enzymatic activity of PhRha78E (A) and PhRha78G (B)

α-L-鼠李糖苷酶PhRha78E的pH值-酶活力曲線（圖4A）顯示，最適反應pH值為6.5，在pH 5.4～7.5之間，相對酶活力在78%以上，即使在酸性pH 4.8仍能保持62%酶活力。PhRha78G的pH值-酶活力曲線（圖4B）顯示其最適反應pH值為7.0，在pH 5.7～8.6之間，相對酶活力在70%以上，即使在堿性pH 9.0依然能有28%酶活力。相同pH值不同反應緩沖體系的酶活力不同，與相同pH值NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖體系相比，Tris-HCl緩沖體系顯著抑制α-L-鼠李糖苷酶PhRha78E和PhRha78G的催化活性。

圖5 溫度對PhRha78E（A）和PhRha78G（B）酶活力的影響Fig.5 Effects of temperature on enzymatic activity of PhRha78E (A)and PhRha78G (B)

α-L-鼠李糖苷酶PhRha78E的反應溫度-酶活力曲線（圖5A）顯示其最適反應溫度為60 ℃，在高溫70 ℃仍能保持69%酶活力。然而，PhRha78G的反應溫度-酶活力曲線（圖5B）顯示其最適反應溫度卻為40 ℃，在低溫20 ℃仍然能保持43%酶活力。雖然二者來源于同一菌株，二者催化活性對溫度的適應性卻差異很大。

酶動力學曲線（圖6）顯示：PhRha78E和PhRha78G對底物PNPR的最大反應速率Vmax較小，表明催化活性較低，分別為124.3 U/g和70.0 U/g，PhRha78E是PhRha78G的1.8 倍；PhRha78E和PhRha78G的轉換數kcat分別為0.18 s-1和0.12 s-1；PhRha78E和PhRha78G的米氏常數Km較小，分別為0.55 mmol/L和0.40 mmol/L；PhRha78E和PhRha78G的催化效率kcat/Km分別為327 L/（mol·s）和300 L/（mol·s）（表3）。

圖6 PhRha78E（A）和PhRha78G（B）酶動力學曲線Fig.6 Enzyme kinetic curves of PhRha78E (A) and PhRha78G (B)

表3 α-L-鼠李糖苷酶的酶動力學常數Table3 Enzymatic kinetic parameters of α-L-rhamnosidases

3 討 論

本研究基于基因組挖掘策略從土壤細菌解肝磷脂土地桿菌基因組中獲得兩個新型α-L-鼠李糖苷酶基因PhRha78E和PhRha78G，目的酶PhRha78E和PhRha78G僅少量以可溶性形式表達于上清液，大部分以包涵體形式存在于沉淀，并且以包涵體表達的PhRha78E和PhRha78G具有α-L-鼠李糖苷酶催化活性，發現了在大腸桿菌中以催化活性包涵體形式異源表達的α-L-鼠李糖苷酶，目的酶蛋白表達量大，每克菌體可制備約0.4 g含目的酶包涵體的沉淀，生產率高，顯著降低了生產成本。

α-L-鼠李糖苷酶PhRha78E和PhRha78G催化活性包涵體的最適pH值分別為6.5和7.0，與已報道細菌源α-L-鼠李糖苷酶相似，處于中性pH值略偏酸性，然而PhRha78E和PhRha78G的活性pH值范圍較寬，同時覆蓋了酸堿性pH值范圍，PhRha78G在堿性pH 8.6仍能保持72%酶活力，這對于黃酮糖苷生物轉化非常重要，因為黃酮糖苷易溶于堿性溶液，然而，迄今為止僅有兩個細菌源α-L-鼠李糖苷酶的最適pH值為堿性。Tris-HCl緩沖液顯著抑制了PhRha78E和PhRha78G的催化活性，與來源于多形擬桿菌的α-L-鼠李糖苷酶BtRha78D和BtRha78E性質一致[29]，這可能是由于Tris的分子結構與α-L-鼠李糖相似，Tris分子含有3 個羥基和1 個氨基，從而可以與α-L-鼠李糖苷酶的催化中心形成氫鍵。PhRha78E和PhRha78G的最適溫度分別為60 ℃和40 ℃，高于原始菌的最適生長溫度，尤其是PhRha78E，70 ℃條件下仍能保持69%酶活力，與已報道細菌源α-L-鼠李糖苷酶相似，較高的反應溫度對于黃酮糖苷生物轉化亦重要，因為高溫有助于黃酮化合物溶解。本研究發現的兩個新型α-L-鼠李糖苷酶雖來源于同一菌株，酶學性質卻差異較大，可應用于不同的生物催化領域，并且豐富了現有α-L-鼠李糖苷酶資源庫。