刺參2 種天冬氨酸蛋白酶的酶學性質及其對自溶的影響

王 玲，年益瑩，薛 鵬，季曉彤，崔鈺婷，張公亮，侯紅漫，孫黎明,*

（1.大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

海參（Stichopus japonicus）是我國經濟價值較高的海珍品之一，富含多糖、膠原蛋白、糖脂等功能活性因子，近年來產量逐年遞增。但是，海參自溶能力很強，在捕撈、運輸、貯藏以及加工過程中均可發生自溶，導致海參原料品質下降。前期研究表明，海參體壁和腸道中的一系列內源性蛋白酶是海參自溶的主導因素，其中組織蛋白酶（cathespin，Cat）對海參自溶起重要作用[1-2]。

在所有Cat中，只有Cat D和Cat E屬于天冬氨酸蛋白酶（EC3.4.23）[3]。Cat D的分布非常廣泛，幾乎在所有組織中都有分布[4]；而Cat E分布則相對局限，只存在于部分組織細胞中[5]。它們雖然是天冬氨酸蛋白酶家族中2 種性質非常相似的蛋白酶，但Cat D分布于溶酶體中，在高等動物的胃部和在其他組織器官都有分布[6-8]。而Cat E并不是溶酶體蛋白酶，而是一種非分泌性的細胞內蛋白酶。同一物種的Cat D和Cat E在理化特性、分子質量、存在形式[9-10]及抗原性[7,11]等方面均有一定差異。

Simon等[12]發現Cat D具有較強的纖維蛋白及纖維蛋白原溶解活性。Helseth等[13]發現Cat D參與原膠原纖維的降解，能夠將原膠原的羧基端前肽水解掉，當pH值為6時，斷裂位點從羧基端端肽移至羧基端端肽/前肽結合處。膠原蛋白是海參的主要結構蛋白，因此，海參內源性Cat D及Cat E很有可能參與海參自溶。

海參Cat D和Cat E相關信息鮮見報道。本實驗以遼寧特產刺參體壁中的Cat D和Cat E為研究對象，對其部分酶學性質進行研究，包括最適pH值、最適溫度和熱穩定性，以及金屬離子、蛋白酶抑制劑和激活劑對Cat D和Cat E活力的影響。進一步利用特異性抑制劑Pepstatin A，考察天冬氨酸蛋白酶對海參自溶過程中蛋白質降解的影響，為進一步闡明Cat D和Cat E在海參自溶中的作用機制及其控制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活刺參購于大連長興市場，30 min內于冰盒中運回實驗室。

MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2（Cat D底物）、MOCAc-Gly-Ser-Pro-Ala-Phe-Leu-Ala-Lys(Dnp)-D-Arg-NH2（Cat E底物）、Z-Leu-Leu-Leu-H（Z-LLL）CA-074 日本Peptide Institute公司；E-64、抗痛素、苯甲基磺酸氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、1,10-菲啰啉、胃蛋白酶抑制劑（pepstatin A，Pep A） 美國Sigma公司；L-半胱氨酸（L-Cys）、碘乙酸、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（trismethyl aminomethane，Tris） 生工生物工程（上海）有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

熒光光譜儀 美國PE公司；PHS-3C型pH計 上海精密科學儀器有限公司；Z-323K型大容量冷凍離心機德國Hermle公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制備

新鮮刺參剖腹去腸，體壁用去離子水洗凈、切碎，按料液比1∶1（g/mL）加入Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH 7.0），勻漿，上述過程中均在冰浴下進行，4 ℃浸提1 h，離心（12 000 r/min，20 min），取上清液即為粗酶液，-80 ℃貯藏備用。1.3.2 酶學性質的測定

1.3.2.1 特異性熒光底物法測定酶活力

取150 μL粗酶液，加入75 μL Tris-HCl反應緩沖溶液(50 mmol/L，pH 7.0)，再加入75 μL（10 μmol/L）特異性底物，混勻后于37 ℃水浴30 min，立即加入300 μL終止液甲醇-異丙醇-水（35∶30∶35，V/V）終止反應，混勻后在各自激發波長和發射波長條件下（Cat D激發波長320 nm，發射波長400 nm；Cat E激發波長328 nm，發射波長393 nm）測定熒光強度，每組實驗均做3 次平行。

以熒光產物7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，MCA）物質的量（μmol）為橫坐標，在其激發波長346 nm和檢測波長439 nm條件下測得的熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線方程為Y=10.06X-0.199 3（R2=0.999 9）。將酶活力定義為：在1 min內水解底物并釋放1×10-3μmol的MCA產物的量為1 個酶活力單位（1 U）。相對酶活力定義為：各種條件下測得的酶活力相對最高酶活力（或對照組酶活力）的百分比。

1.3.2.2 最適pH值的測定

配制pH值分別為2～11的緩沖液作為反應緩沖液，按照1.3.2.1節中的方法測定不同pH值條件下Cat D和Cat E的活性。各反應緩沖液分別為：0.2 mol/L Gly-HCl 緩沖液（pH 2～3），0.2 mol/L HAc-NaAc緩沖液（pH 4～5），0.2 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（pH 6～8），0.2 mol/L Gly-NaOH 緩沖液（pH 9～10），0.2 mol/L的Na2CO3-NaHCO3緩沖液（pH 11）。

1.3.2.3 最適溫度的測定

取150 μL粗酶液，加入75 μL最適pH值反應緩沖溶液，再加入75 μL底物，混合均勻，分別于10～80 ℃反應30 min后立即加入300 μL終止液，混勻后測定熒光強度。

1.3.2.4 熱穩定性的測定

取150 μL粗酶液分別于20～80 ℃水浴30 min后，加入75 μL最適反應緩沖溶液，再加入75 μL底物，混合均勻。分別于最適溫度下反應30 min后立即加入300 μL終止液，混勻后測定熒光強度。

1.3.2.5 金屬離子對酶活力的影響

取75 μL粗酶液，加入150 μL含有10 mmol/L金屬離子Mn2+、Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+的最適緩沖溶液，常溫孵育30 min，加入75 μL底物，混合均勻。分別于最適溫度下反應30 min后加入300 μL終止液，混勻后測定熒光強度。對照組用最適pH值緩沖液代替金屬鹽溶液，其余操作不變。

1.3.2.6 抑制劑與激活劑對酶活力的影響

取75 μL粗酶液分別與含有20 μmol/L CA-074、2 mmol/L Z-LLL、2 mmol/L碘乙酸、20 μmol/L E-64、0.5 mmol/L抗痛素、2 mmol/L PMSF、2 mmol/L 1,10-菲啰啉、2 mmol/L DTT、2 mmol/L L-Cys、2 mmol/L EDTA的緩沖液等體積混合，室溫孵育30 min，加入75 μL最適pH值緩沖液和75 μL底物，分別于最適溫度下反應30 min，加入300 μL終止液，混勻后測定熒光強度。對照組用最適pH值緩沖液代替抑制劑，其余操作不變。

1.3.2.7 Pep A對刺參自溶的影響

將新鮮刺參切碎，勻漿，取2 g勻漿物加入試管中，再加入2 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0），分為4 組，每組3 管。第1組：立即加入2 mL蛋白提取緩沖液（2%十二烷基硫酸鈉，8 mol/L尿素，5% DTT，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5），振蕩12 h，沸水浴5 min，離心（4 000 r/min，15 min），取上清液備用。第2組：于25 ℃孵育（自溶）6 h，然后加入2 mL蛋白提取緩沖液，后續步驟同第1組。第3、4組：添加終濃度分別為0.2、0.4 mmol/L的Pep A，于25 ℃孵育6 h，然后立即加入2 mL蛋白提取緩沖液，后續步驟同第1組。采用5%濃縮膠，8%分離膠進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。電泳后，膠塊用清水洗滌后，于0.125%考馬斯亮藍R-250中染色3 h后，用甲醇-醋酸-水溶液脫色后進行凝膠成像。

2 結果與分析

2.1 Cat D和Cat E的最適pH值

圖1 Cat D和Cat E的最適pH值Fig.1 Optimum pH values for Cat D and Cat E

如圖1所示，隨著pH值的增大，Cat D和Cat E的酶活力分別在pH 5和pH 4時達到酶活力高峰；在隨后的酶活力下降過程中，兩者呈現一定差異，Cat E酶活性下降較為緩慢，而Cat D酶活性則快速下降。在pH 8～10范圍內，Cat E的相對酶活力保持在40%左右，而Cat D的相對酶活力則僅為10%～17%。

關于Cat D的最適pH值研究報道較多。在水產動物方面，Venugopa等[14]發現貽貝Cat D的最適pH值為3.5。Goldman-Levkovitz等[15]測得鯉魚Cat D在pH 3.0呈現酶活力峰值，之后隨著pH值升高，活性直線下降，至pH 5.0時酶活性降為最大酶活力的40%以下。Wang等[16]測得大西洋鱈魚（Clupea harengus）肌肉中Cat D的最適pH值也為3.0，當pH值升至4.5和5.2時活性僅為最大酶活力的50%和20%。Balti等[17]研究了魷魚肝胰腺Cat D的理化特性，其最適pH值也為3.0。Liu Zhongyi等[18]報道草魚腸道Cat D的最適pH值為2.5。Nielsen等[19]測得大西洋鯡魚的最適pH值為2.5，當pH值升到4時，活性降低50%；當pH值為6時，酶活性幾乎為零。

在陸生動物方面，Krause等[20]報道了鴕鳥Cat D的最適pH值為4。Simon等[12]發現人Cat D最適pH值在3.5，在pH值為5時，酶活力則降為最大酶活力的50%。Yasuda等[21]測得大鼠胃和脾Cat D的最適pH值為4，當pH值升到6.5時，酶活力降為最大酶活力的10%以下。

上述結果表明，不同物種Cat D最適pH值均在2.5～4范圍內，且對pH值的敏感性較強，一般在pH 5時活性就顯著降低；不同物種Cat D間最適pH值差異較大的原因可能有如下兩點：1）不同物種以及同一物種不同組織細胞來源Cat D的結構功能不同，其最適pH值存在差異。2）不同研究者用的底物不同，很可能是另一個主要原因[22-23]。Komai等[24]分別用酸變性血紅蛋白、酸變性酪蛋白和特異性熒光底物，測得太平洋褶魷魚Cat D的最適pH值分別為3.5、2.2和3.0，可見底物種類對判定最適pH值有較大影響。

關于Cat E的研究報道較少，Inokuchi等[10]發現牛蛙Cat E在pH 2.5顯示最大酶活力，而當pH值升至4時，酶活力降為35%，pH值升至5時，酶活性幾乎全部消失。Yasuda等[21]測得大鼠胃和人紅細胞Cat E的最適pH值為4，當pH值升到6時，酶活力降為最大酶活力的20%以下。

Cappiello等[25]發現重組pro-Cat E的最大反應速率在pH 4.0時，隨著pH值上升，反應速率下降，pH值升至5.0時，反應速率降為0；而活化形式的Cat E則在pH 3.5～4.5范圍內反應速率均穩定在最高水平，但pH值升至4.8時，反應速率降為最大反應速率的40%下，當pH值升至5.25時，反應速率降為零。同樣，Zaidi等[26]測得重組人Cat E在中性pH值時幾乎沒有活性。Zeleznik等[27]研究了重組人類Cat E的最適pH值也為4.0，當pH值高于4.0時，活性迅速下降，pH 6.0時殘余酶活力為50%，但在pH 6.0～8.0，酶活力則抑制維持在50%左右，pH 8.5時徹底失活。Yasuda等[21]關于人紅細胞Cat E的報道，也有相似的結果。Lapresle等[28]發現兔脾臟Cat E在pH 2.5呈現峰值，但當pH值升至5時，酶活性則降至峰值的5%左右。

大多數報道均顯示Cat D和Cat E的最適pH值在酸性范圍。Athauda等[29]發現Cat E的最適pH值雖然在酸性范圍，但其在中性pH值時仍可以保持一定活性，而且顯示出不同的酶解切割特異性。在pH 5.5及pH 3.0時，Cat E傾向于水解Phe-X、Tyr-T、Leu-X等肽鍵，而當pH值為中性時Cat E則選擇性地水解Glu13-Ala14肽鍵。當pH值為7.4時，Cat E則選擇性地水解Arg-X和Glu-X肽鍵，尤其對Arg-Arg鍵則更為優先水解[30-31]。同樣，Cat D也有相似現象。

上述研究表明，Cat D和Cat E的酶活力對環境pH值很敏感，其酶活力在較為狹窄酸性pH值范圍內才能發揮作用。由圖1可知，在中性及堿性范圍內，Cat E酶活力具有一定的穩定性。刺參受外界環境刺激發生自溶后，會相繼發生細胞及溶酶體破裂，釋放的Cat E和Cat D會在短時間內水解刺參結構蛋白。但是，刺參體液pH值為中性偏堿性，兩者的pH值穩定性差異表明，Cat E在中性及堿性環境下依然具有酶活力。因此，相對Cat D而言，Cat E對刺參自溶的貢獻可能更大。

2.2 Cat D和Cat E的最適溫度

由圖2可知，在溫度為40 ℃時，Cat E達到酶活力高峰，而Cat D在60 ℃左右酶活力達到峰值。當溫度升至70 ℃，Cat D的相對酶活力維持在65%左右，而Cat E的相對酶活力則降低至不到10%，表明Cat D具有較強的熱穩定性，而Cat E對環境溫度的敏感性較高。

同樣，貽貝Cat D最適溫度也為60 ℃，溫度升至80 ℃時活性降至最大活性的60%左右[13]。鯉魚Cat D在43～55 ℃范圍內活性可一直維持在峰值水平[14]。歐洲橫紋烏賊肝胰腺Cat D最適溫度為50 ℃，但酶活性隨著溫度高于50 ℃而迅速降低，在60 ℃和65 ℃時，活性分別為最大活性的55.1%和32%[17]。草魚腸道Cat D的最適溫度為37 ℃，在50 ℃孵育30 min后，活性降至最大活性的20%[15]；大西洋鯡魚Cat D的最適溫度也為37 ℃[20]。鴕鳥Cat D在45 ℃顯示出最大酶活力，但在70 ℃時，酶活力分別降至52%和36%[17]。莫桑比克羅非魚Cat D最適溫度為50 ℃，在此溫度下孵育10、60 min，活性損失20%、35%；但在60 ℃孵育10、60 min后，活性分別降低60%、90%[18]。大西洋鮭魚肌肉Cat D最適溫度也為50 ℃[19]。Yasuda等[22]發現人紅細胞Cat D和鼠胃Cat E均在45 ℃呈現最大酶活性。

圖2 Cat D和Cat E的最適溫度Fig.2 Optimum temperatures for Cat D and Cat E

2.3 Cat D和Cat E的熱穩定性

溫度對Cat D和Cat E酶活力的影響如圖3所示。刺參體壁的Cat D和Cat E在溫度20～40 ℃時，酶活力較為穩定，溫度超過50 ℃酶活力急劇下降，但Cat D下降的速度較Cat E略緩慢，證明了Cat D較Cat E具有較強的熱穩定性。

與陸生動物比較，海洋動物體內蛋白酶的熱敏性更高，更易失活。大西洋鱈魚Cat D的熱穩定性很低，在40 ℃孵育15 min后，活性就全部消失，而牛Cat D在45 ℃酶活很穩定，在60 ℃孵育15 min后，酶活力才明顯下降[16]。盡管歐洲橫紋烏賊肝胰腺Cat D在50 ℃呈現最大酶活力，但在50、55 ℃和60 ℃孵育30 min后，活性降至最大活性的75.2%、49%和20.5%，在65 ℃孵育30 min后活性已經喪失[17]。馬鮫魚Cat D在50 ℃孵育20 min后活性降至初始值50%以下[32]。

大西洋鯡魚與牛Cat D在較高溫度具有相似的熱穩定性，65 ℃孵育1 h后的活性幾乎沒有下降；而鮭魚Cat D在50 ℃孵育3 min后，活性幾乎全部喪失[20]。南極冰魚Cat D具有較強的熱穩定性，在50 ℃孵育55 min后，其Cat D活性還能夠保持最大活性的50%，而人類Cat D在50 ℃半衰期只有3 min，虹鱒魚肝臟Cat D在50 ℃孵育不到2 min，酶活性就全部喪失[33]。

圖3 Cat D和Cat E的熱穩定性Fig.3 Thermal stabilities of Cat D and Cat E

2.4 金屬離子對Cat D和Cat E的影響

圖4 金屬離子對Cat D和Cat E活力的影響Fig.4 Effects of metal ions on activities of Cat D and Cat E

金屬離子對Cat D和Cat E酶活力的影響如圖4所示，Ca2+、Mg2+對Cat D、Cat E活性的影響不大。Zn2+對Cat D的抑制作用較強，但不會抑制Cat E的活性。Fe2+能夠抑制Cat D和Cat E的活性，抑制率分別為29.2%和82.2%；Fe3+對Cat D和Cat E的抑制作用更強，抑制率分別為56.5%和99.1%，能夠完全抑制Cat E的活性。Cu2+、Mn2+均對Cat D有較強的抑制作用，對Cat E的抑制作用相對較弱。

金屬離子是影響蛋白酶活性的一個重要因素。一方面，金屬離子可能抑制蛋白酶的活力，其機制可能是：1）與蛋白酶活中心氨基酸上的基團（例如半胱氨酸的巰基）結合，從而抑制酶的活性；2）與蛋白酶非活性中心的氨基酸結合，影響蛋白酶空間構象，從而降低酶活力。相反，金屬離子還可能作為激活劑提高蛋白酶的活力，尤其是活性中心依賴金屬離子的金屬蛋白酶，金屬離子作為金屬蛋白酶的輔基，與氨基酸結合形成穩定常數較高的配合物，從而提高蛋白酶的活力。

由圖4可知，Zn2+、Fe2+、Fe3+、Cu2+和Mn2+分別對刺參Cat D或Cat E均有一定抑制作用，但抑制作用有明顯差異，提示這2 種天冬氨酸蛋白酶與上述離子的相互作用存在較大不同。

2.5 抑制劑和激活劑對Cat D和Cat E的影響

由圖5可知，所用的幾種蛋白酶抑制劑和激活劑對Cat D和Cat E的作用幾乎是一致的。Pep A、Z-LLL、PMSF、1,10-菲啰啉能夠抑制兩者活性，抑制率分別約為98%～99%、65%～78%、30%～35%、19%～23%。Pep A幾乎可完全抑制兩者的酶活力，證明兩者均為天冬氨酸蛋白酶。兼具絲氨酸蛋白酶和木瓜蛋白酶抑制作用的PMSF對兩者的抑制率為30%～35%，金屬離子螯合劑1,10-菲羅啉對兩者的抑制率為19%～23%，提示Cat D和Cat E的活性中心附近很可能有絲氨酸參與酶活性的調節，而且兩者有一定的金屬離子依賴性。同為金屬離子螯合劑的EDTA卻對兩者活性有一定促進作用，可分別將Cat D和Cat E的活力提高6.6%和7.9%。有較多報道顯示，EDTA對組織蛋白酶等酸性蛋白酶具有激活作用[34-35]。由此可以推測，EDTA對兩者酶活力的提升作用很可能遠大于其螯合金屬離子而發揮的酶活抑制作用。

圖5 蛋白酶抑制劑和激活劑對Cat D和Cat E活性的影響Fig.5 Effects of protease inhibitors and activators on Cat D and Cat E

具有較強還原能力和巰基激活能力的DTT和L-Cys對Cat D和Cat E均有激活作用，其中DTT將兩者活性均提高了31%，L-Cys分別將Cat D和Cat E活性提高了9.64%和7.58%。這提示Cat D和Cat E分子結構中帶有較多的半胱氨酸，這些半胱氨酸極易形成二硫鍵，DTT能夠打開二硫鍵，使巰基處于還原狀態，L-Cys能夠保護游離巰基不形成二硫鍵，從而對Cat D和Cat E活性起到一定的激活和保護作用。

Z-LLL是半胱氨酸蛋白酶Cat K的特異性抑制劑，對Cat D和Cat E的抑制率分別為78.15%和65.21%，提示Cat D和Cat E與Cat K酶活中心結構有較強的相似性。盡管E-64、抗痛素和碘乙酸均為半胱氨酸蛋白酶抑制劑，但對Cat D和Cat E的作用卻不一致，抗痛素對酶活力無明顯影響，而碘乙酸則表現出一定的激活效應，Cat D和Cat E的酶活力分別增加至112.52%和110.46%，這進一步提示Cat D和Cat E與其他組織蛋白酶具有較大差異。

上述結果提示Cat D和Cat E為具有一定金屬離子依賴性的天冬氨酸蛋白酶，其活性中心周圍可能有半胱氨酸和絲氨酸參與酶活力的調節。

2.6 Pep A對刺參自溶的影響

由圖6可知，新鮮刺參蛋白提取物中，以分子質量較大的蛋白質為主，分子質量集中在114～200 kDa范圍內和44.3 kDa處。刺參自溶6 h后，200 kDa的大分子蛋白質發生降解。加入終濃度分別為0.2、0.4 mmol/L的Pep A后，該大分子蛋白的降解明顯受到抑制。

Pep A是天冬氨酸蛋白酶特異性抑制劑，它能夠抑制海參自溶過程中大分子蛋白的降解，說明Pep A通過抑制海參內源性天冬氨酸蛋白酶實現自溶抑制作用。由此可以推測，天冬氨酸蛋白酶很有可能參與刺參自溶過程。研究發現，海參內源性半胱氨酸蛋白酶和基質金屬蛋白酶均參與海參自溶[1,36]，但天冬氨酸蛋白酶是否參與自溶鮮見報道。Eakpetch等[37]在蝦肉中加入Pep A，發現南美白對蝦的自溶能夠明顯受到抑制，從而確認天冬氨酸蛋白酶是引起南美白對蝦自溶的主要蛋白酶。除了分布于動物胃腸中的胃蛋白酶，生物體細胞內的天冬氨酸蛋白酶主要包括Cat D和Cat E。因此，本實驗所考察的刺參體壁天冬氨酸蛋白酶必然以Cat D和Cat E為主，由此可以推測Cat D和Cat E很有可能參與了刺參自溶。

圖6 Pep A對刺參自溶自溶過程蛋白降解的影響Fig.6 Effect of Pep A on protein degradation during autolysis of sea cucumber

3 結 論

刺參Cat D最適pH 5.0、最適溫度60 ℃，Cat E最適pH 4.0、最適溫度40 ℃，兩者在20～40 ℃酶活力較為穩定。Zn2+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+可抑制Cat D的活性。Fe3+、Fe2+、Cu2+可抑制Cat E的活力，但同一金屬離子對兩者抑制程度不一致；Cat D和Cat E均為具有一定金屬離子依賴性的天冬氨酸蛋白酶，其活性中心周圍可能有半胱氨酸和絲氨酸參與酶活力的調節。Cat D和Cat E很有可能參與刺參自溶過程中蛋白質的降解。