1 株牦牛源產細菌素植物乳桿菌的益生特性分析

周晏陽，孔雪英，吳 梅，湯 承*

（西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041）

牦牛是青藏高原山脈附近的特有畜種，是牧民賴以生存的生產與生活資料[1]。由于牦牛制品如牦牛肉干、牦牛肉醬、牦牛酸奶和奶酪等天然、綠色、風味獨特的特點，受到了廣大消費者的喜愛[2-3]。但牦牛制品中的食源性致病微生物問題卻不容忽視。胡萍等[4]報道天祝白牦牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率為26.67%，牦牛肉干中金黃色葡萄球菌檢出率為14.70%；孔雪英等[5]也在新鮮牦牛肉中檢出了致病性沙門菌。肉制品與奶制品中的食源性致病微生物給牧民和消費者健康帶來極大的風險。

乳酸菌普遍存在人與動物體內，是國際公認食品級安全微生物[6]。乳酸菌不僅可以改善胃腸道微生態環境，還可以刺激黏膜和全身免疫，發揮免疫調節功能，促進動物生長發育，提高腸黏膜免疫等[7-9]。FAO/WHO的標準認定益生菌篩選必須滿足3 個基本特點：耐受胃腸黏膜的選擇環境；黏附宿主的腸壁細胞；分泌物或者分解產物為抗菌物質[10]。微生態制劑在反芻動物養殖尤其是養牛生產中的應用還處于剛剛起步的階段，但專門針對牦牛的微生態制劑和食品添加劑還處于研究階段，并沒有商品化的產品[11-13]。本實驗通過評價牦牛源產細菌素植物乳桿菌SWUN5815的益生性能，以期為牦牛源益生菌的開發提供新的菌種資源，為進一步開發牦牛專用的微生態制劑以及食品添加劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌SWUN5815以及牦牛源大腸桿菌、牦牛源沙門菌、牦牛源金黃色葡萄球菌、牦牛源芽孢桿菌均由西南民族大學動物醫學實驗室鑒定保存。

MRS固體培養基、MRS肉湯培養基、營養瓊脂培養基、藥敏片、MH（Muller-Hinton）培養基、胰酪胨大豆肉湯培養基 杭州微生物試劑有限公司；蛋白酶K、過氧化氫酶 美國Solarbio公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑、DL 2000 DNA Marker大連寶生物公司；Caco-2細胞、胎牛血清 以色列BI公司；牛膽鹽 青島海博公司；分泌型免疫球蛋白A（SIgA）檢測試劑盒 武漢華美生物科技有限公司。

雌性清潔級昆明小鼠，體質量16～18 g，購于成都達碩生物公司，飼養環境為SPF級實驗動物房。

1.2 儀器與設備

DELTA 320PH酸度計、Biophotometer紫外分光光度計德國Eppendorf公司；Model 680型酶聯免疫檢測儀美國Bio-Rad公司；牛津杯（內徑6 mm，外徑8 mm，高10 mm） 上海化科實驗器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的活化

將實驗室甘油保種的SWUN5815接種到MRS固體培養基培養，傳3 代確保SWUN5815活性良好。

1.3.2 16S rRNA基因序列分析及系統發育樹構建

按照操作說明提取SWUN5815純化培養物的基因組DNA作為PCR模板，基于16S通用引物PCR擴增得到16S rRNA基因序列并且構建系統發育樹。

1.3.3 生長曲線的測定

將充分活化的菌株傳代培養后按照1%的量接入200 mL的MRS液體培養基中，37 ℃培養，于不同時間取樣。每間隔2 h取1 次樣，測定樣本OD600nm值，并記錄數據，構建生長曲線。

1.3.4 對牦牛常見腹瀉病原菌抑制的測定

選取牦牛源性致病病原菌沙門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及牦牛胃腸道分離的芽孢桿菌等13 株菌作為指示菌，參照文獻[14]測定植物乳桿菌SWUN5815細菌素的抑菌能力。

1.3.5 抗生素敏感實驗

實驗菌株的制備：大腸桿菌（ATCC25922）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）質控菌株種子液以1%接種于3 mL TSB培養基，180 r/min、37 ℃搖菌6 h；植物乳桿菌種子液以1%接種于4 mL MRS肉湯，37 ℃靜置培養12 h。

用無菌棉拭子蘸取已經校正的0.5麥氏比濁濃度的SWUN5815菌液，均勻地涂布整個MH培養基表面。取藥敏紙片貼于平板表面，每個平板貼4 張紙片。每個平板各設3 個平行組。用大腸桿菌（ATCC25922）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）作質控菌株，37 ℃培養12 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑[15]。

1.3.6 耐酸和耐膽鹽實驗

將植物乳桿菌菌株SWUN5815接種于MRS液體培養基，37 ℃培養16 h后。將菌液調整pH值為2.0、3.0和終質量分數為0.3%牛膽酸鹽，空白對照為相同時間的菌液。37 ℃恒溫培養3 h后，分別進行活菌計數。實驗重復3 次，并按式（1）計算細菌存活率，即可代表菌株對酸或者膽鹽的耐受性[16]。

1.3.7 SWUN5815對Caco-2細胞的黏附實驗

1.3.7.1 SWUN5815菌液準備

將植物乳桿菌SWUN5815接種于新鮮的MRS液體培養基，37 ℃靜置培養12 h。分別將生長至對數生長期的植物乳桿菌在5 000 r/min離心15 min。收集菌體后用無菌的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌2次，最后重懸于無菌PBS中，調節細菌的濃度為1×108CFU/mL。

1.3.7.2 熒光標記SWUN5815

將上述準備好的植物乳桿菌SWUN5815懸浮于100 mg/mL異硫氰酸熒光素中，放置37 ℃恒溫培養箱暗處作用1 h，再用無菌的PBS洗滌除去未結合的異硫氰酸熒光素，然后把細菌懸浮于無菌PBS中，調節其終濃度為1×108CFU/mL。

1.3.7.3 Caco-2細胞的培養

Caco-2用無菌細胞培養瓶培養，在細胞瓶中加入含10%的熱滅活胎牛血清和含100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素雙抗的DEME細胞培養液，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養。

1.3.7.4 黏附實驗

1 mL細胞培養液及1 mL熒光標記的SWUN5815混勻，以不加菌的細胞為空白對照。培養板水平置于37 ℃的CO2恒溫培養箱中孵育1 h，用無菌PBS將未黏附的菌洗脫。加入0.1 mL的胰酶細胞完全脫落，加入0.4 mL完全培養液終止反應，用酶標儀測定細胞懸液的熒光強度，發射光波長為530 nm，吸收光波長為485 nm，設置3 個平行對照[17]。細菌的黏附率計算如式（2）所示：

1.3.8 SWUN5815對小鼠體質量影響的測定

經1 周的適應性飼喂后，將48 只小鼠隨機分為兩組，每組24 只。根據前期飼喂濃度對小鼠體質量影響的結果，確定109CFU/mL為最佳的飼喂濃度。因此，實驗組小鼠灌胃飼喂0.5 mL植物乳桿菌（109CFU/mL），對照組小鼠灌服等量的MRS培養基，每天1 次，連續7 d；對照組和實驗組小鼠均自由采食。在灌胃結束后的第1、7、14、21天對各組小鼠稱質量，并記錄結果。

1.3.9 腸黏膜SIgA分泌的測定

每7 d稱質量后每組隨機取3 只實驗組與3 只對照組小鼠，刮取小腸黏膜加入等體積的PBS（pH 7.4）混勻，以6 000×g離心15 min，獲得上清液于-20 ℃保存備用。采用雙抗夾心ELISA法測定采集樣本的SIgA含量，具體操作參照試劑盒使用說明書[18]。

2 結果與分析

2.1 SWUN5815株的菌落形態及細胞形態特征

圖1 SWUN5815照片（A）和顯微鏡圖（B）（×40）Fig.1 Colony morphology (A) and positive Gram-staining (B) of SWUN5815 (× 40)

如圖1所示，SWUN5815在MRS固體培養基上菌落形態呈圓形，顏色呈乳白色，表面光滑濕潤，顯微鏡下呈短桿狀，無芽孢，革蘭氏染色呈陽性。

2.2 SWUN5815 16S rRNA序列PCR擴增結果及系統進化樹構建

按照PCR條件進行擴增，瓊脂糖電泳檢測結果顯示SWUN5815 16S rRNA基因擴增片段大小約為1 500 bp，與預期片段大小相符（圖2）。根據16S rRNA序列測序結果，將其與GenBank中不同來源的植物乳桿菌相同區段基因序列構建系統進化樹。從圖3可看出，11 株植物乳桿菌分為兩大支，SWUN5815與綿羊和山羊源的植物乳桿菌的遺傳進化關系較近。

圖2 SWUN5815 16S rRNA序列PCR擴增電泳圖Fig.2 Electropherogram of PCR amplif i cation products of 16S rRNA sequence from SWUN5815

圖3 SWUN5815 16S rRNA系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of SWUN5815 based on its 16S rRNA sequences

2.3 SWUN5815的生長曲線

以SWUN5815的培養時間為橫坐標，其OD600nm為縱坐標。如圖4所示，SWUN5815菌株在0～2 h處于適應期，2～12 h為對數期，大約到12 h達到生長高峰，12～24 h為穩定期，從該曲線上可以確定該菌體的最佳收獲時間是11 h。

圖4 植物乳桿菌SWUN5815菌株培養時間與OD600 nm的關系Fig.4 Relationship between culture time and OD600 nm value of SWUN5815

2.4 SWUN5815對牦牛源病原菌的抑制結果

由表1可知，SWUN5815所產細菌素對牦牛源腸道菌具有廣譜抑菌活性。

表1 SWUN5815對指示菌和牦牛源臨床分離株抑制效果Table1 Antimicrobial spectrum of bacteriocin produced by SWUN5815

2.5 SWUN5815抗生素敏感實驗結果

本實驗中質控菌株大腸桿菌（ATCC25922）和金葡球菌（ATCC25923）的抗藥性證明了結果的可靠性。根據美國臨床標準委員會（NCCLS）推薦的K-B紙片擴散法檢測乳酸菌對多種藥物的敏感性。由表2可知，牦牛源植物乳桿菌SWUN5815對常用的9 種常用抗生素敏感。

表2 SWUN5815抗生素敏感實驗結果Table2 Antibiotic susceptibility of SWUN5815

2.6 SWUN5815耐酸和耐膽鹽能力

表3 SWUN5815對酸和膽鹽耐受結果Table3 Acid and bile salt tolerances of SWUN5815

如表3所示，SWUN5815對pH 2.0和pH 3.0的不同生長環境表現出了不同程度的耐受性。在pH 2.0的環境下存活率為58.2%，在pH 3.0的環境下的存活率達到86.9%。SWUN5815在0.3%的牛膽酸鹽存在條件下培養3 h后，其對0.3%膽鹽的耐受率約為66.8%，說明其對膽鹽的耐受性較好。

2.7 SWUN5815對Caco-2細胞的黏附效果

將標記好的SWUN5815與Caco-2細胞孵育結束后，計算得到SWUN5815對Caco-2細胞的黏附率為42%。

2.8 SWUN5815對小鼠體質量的影響

表4 植物乳桿菌SWUN5815對小鼠體質量的影響Table4 Effects of L. plantarum SWUN5815 on body mass of mice g

由表4可知，在灌胃7、14、21 d后5×108CFU組平均質量增加值均高于對照組。在灌胃7 d后5×108CFU組的平均體質量已經顯著高于對照組（P＜0.05），灌胃21 d，5×108CFU組小鼠的體質量與對照組相比差異極顯著（P＜0.01）。結合飼喂不同濃度植物乳桿菌SWUN5815的各時間段內小鼠體質量的變化結果表明，植物乳桿菌SWUN5815能夠顯著提高小鼠體質量。

2.9 SWUN5815對小鼠小腸黏膜SIgA的影響

表5 植物乳桿菌SWUN5815對小鼠腸黏膜SIgA質量濃度的影響Table5 Effects of L. plantarum SWUN5815 on SIgA concentration in mouse intestinal mucosa at different time points ng/mL

由表5可知，5×108CFU組的植物乳桿菌SWUN5815能夠極顯著提高SIgA的分泌（P＜0.01）。

3 討 論

SWUN5815對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有不同程度的抑制作用。已報道可以同時抑制革蘭氏陰性菌與陽性菌的乳酸菌并不多，如植物乳桿菌ZJ317、P158d等[19-20]。這可能是由于SWUN5815分泌不同類的細菌素造成的，集中細菌素協同發揮作用。細菌素的分泌量與外界環境有很大的關系，所以抑菌實驗的時候環境要很穩定。作為對人類和動物的健康有益的活益生菌，乳酸菌必須滿足一些基本的要求，才能在胃腸道內存活，調節腸道微生態平衡，發揮益生作用。對于反芻動物而言，復胃消化是其重要的生理特點，小腸中高質量分數的膽鹽環境也不利于益生菌的存活，一般動物的小腸內膽鹽質量濃度為0.3～3.0 g/L。乳酸菌需要耐受胃腸道的選擇性環境，所以胃腸道的特殊環境是篩選菌株的第一要素，這也是其能否在腸道定植發揮其益生功能的關鍵[21]。優秀的乳酸菌必須能夠耐受胃腸道低pH值、膽鹽和酶類，并且在營養學和免疫學上，可促進宿主的生長[22]。黃堅等[23]篩選的幾株優秀耐久腸球菌在pH 3.0的環境下存活率最高達到84%，最低為62%，均低于SWUN5815；在0.3%的牛膽酸鹽條件下存活率最高73%，最低為52%，而SWUN5815的存活率為66.8%，與其相差不大。

通過研究植物乳桿菌SWUN5815的生物學特性表明，該分離株的對數生長期長，繁殖快，平臺期維持時間長，因此十分適于大量發酵生產。該菌株耐酸和耐膽鹽能力突出，是其在消化道環境內適應存活的前提。SWUN5815對常見的多種抗生素均表現出敏感性，并且可以有效地抑制病原微生物的生長，顯示出了其作為候選益生菌株的潛力。一些乳酸菌屬的益生菌株會對某些抗生素具有抗性，這可能與其攜帶的相關抗性基因有關，但這些抗性可能是內源性或者天然性的，不一定具有轉移性。該菌株還能表達分泌細菌素，具有很好的抗微生物活性，因此在應用時需要綜合考慮它們的表型及基因型特征與益生特性的關系。

檢測黏附性強弱是益生菌篩選過程中的首要指標，因為較強的腸道黏附能力能讓乳酸菌在腸道停留更長的時間，是后續發揮益生效應的前提條件[24]。乳酸菌進入消化道后，需要與腸道黏液中的蛋白受體進行接觸附著后才能進行定植和發揮作用，并且可以競爭性抑制病原菌與腸黏液的黏附，保護機體不受侵害[25-26]。細菌配體和特定的真核受體是細菌黏附的重要因素，因此人腸上皮樣細胞Caco-2是研究益生菌或病毒在腸道中黏附情形很好的模型。其中Caco-2細胞形態和功能與正常的小腸上皮細胞非常接近，比如含有腸道上皮細胞絨毛以及相應的酶 ，因此被廣泛用于細菌黏附性、免疫調節、小腸對營養物質和新藥物的吸收情況等實驗[27]。植物乳桿菌SWUN5815與Caco-2細胞可以很好地發生黏附，白潔等[16]研究表明植物乳桿菌的黏附率大于腸球菌、致病菌（K88）以及乳球菌，其植物乳桿菌的黏附率可以達到60%。林雪彥等[28]也報道乳酸桿菌對Caco-2有很好的黏附效果。乳酸菌為兼性厭氧菌，并且能夠形成生物膜，這也更利于其在腸道內進行快速定植并發揮作用[29]。

本實驗研究結果表明SWUN5815在灌胃7 d就可以顯著提高小鼠的腸黏膜免疫，前面實驗證明了SWUN5815具有良好的黏附性能，而乳酸菌的黏附性是決定其免疫調節活性的關鍵因素。SWUN5815進入到腸道后，可以黏附到腸上皮細胞，其菌體本身和代謝產物能夠刺激腸黏膜免疫系統，促進SIgA的分泌。黏附性強的乳酸菌能延長與宿主細胞的相互作用時間，從而更好地增強機體的免疫應答[30]。也有可能是SWUN5815通過合成分泌細菌素、抗氧化活性酶和降膽固醇相關酶來提升動物的抗病能力[31]。

SWUN5815分離于牦牛腸道，具有種屬特異性，所以更適應青藏高原的生態環境。并且其分泌的細菌素對牦牛體內常見的病原菌均有良好的抑制作用，在牦牛奶制品和肉制品加工和貯藏過程中可以有效阻止微生物的污染，所以無論作為食品添加劑或者微生態制劑SWUN5815都是十分有潛力的優良益生菌株。