腸炎沙門菌的溫度、pH值和水分活度主參數模型的構建

戚 成，吳雪揚，陳元美，杜建萍，崔 旸，張春艷，王 翔，劉 箐，董慶利,*

（1.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093；2.北京市食品安全監控和風險評估中心，北京 100053）

沙門菌屬（Salmonella spp.）是在血清學上相關的兼性厭氧革蘭氏染色陰性直桿菌。沙門菌大部分具有兩端鈍圓的形態特征，廣泛存在于自然界中[1]，能夠在溫度7～45 ℃的條件下生長，最適生長溫度為35～37 ℃，最適生長pH值為7.2～7.4。沙門菌在外界的生存能力較強，在水中不易繁殖但可以存活2～3 周，其對高溫、陽光直接照射以及常用的消毒藥品非常敏感，不能耐受較高鹽濃度，鹽質量分數9%以上就會死亡[2]。在食品加工中，如果食品內部無法達到殺死沙門菌或破壞毒素的溫度時，細菌和毒素就會有所殘留從而引發污染。唐靚等[3]報道的我國2010—2013年食源性致病菌監測結果顯示，沙門菌在肉類中檢出率最高為12.55%；其中2006—2012年間上海市生肉中沙門菌檢出率高達14.71%。根據1999—2014年我國食物中毒致病因素統計結果顯示[4]：微生物性食物中毒占34.61%，其中沙門菌占40%，占細菌性食物中毒事件的首位[5]，因此對沙門菌造成的食品污染有待進一步調查和研究[6]，從源頭上控制沙門菌危害并進行風險評估。

主參數模型（cardinal parameter model，CPM）是一種主要經驗二級模型[7]，最早由Rosso等[8]提出，通過只定義主要基本環境因子參數（最大值、最小值和最適值）和最適條件時的最大生長率的數值描述微生物生長率和溫度的方程，隨后又分別于1995年和2001年提出了pH CPM[9]和水分活度CPM[10]，近年來模型不斷被完善，已經發展成為研究微生物的重要工具[11-13]。CPM作為一種研究致病菌生長狀況的工具，其優點在于易于獲得參數的初始值，且與Gamma概念相似假定環境因素影響是倍增的。CPM在國外已被應用于大量研究中，Dimakopoulou-Papazoglou等[12]建立了不同pH值和水分活度腸炎沙門菌生物膜形成的CPM，并證明了環境對生物膜形成的影響可通過數學模型定量表達，為食品工業提供了生物膜控制的有用信息。此外Garcia等[14]構建了赭曲霉在不同溫度和水分活度下的生長界面主參數模型，并通過CPM預測得到了赭曲霉生長邊界從而防止其生長。目前國內對致病菌CPM的研究相對較少，董慶利等[15]構建了銅綠假單胞菌遲滯期關于不同溫度、pH值和乳酸鈉濃度的CPM，并驗證了其能夠較好地預測銅綠假單胞菌的生長情況。

為探究腸炎沙門菌在不同環境條件下的生長規律，本研究以液體培養基為基質，建立腸炎沙門菌在不同溫度（30～42 ℃）、pH值（6.6～8.0）、水分活度（aw）（0.976～0.997）環境影響下的CPM。此外，通過數學檢驗值參數以及隨機實驗驗證構建的CPM在預測腸炎沙門菌在緩沖蛋白胨水（buffered peptone water，BPW）中生長的有效性，為實際食品生產、保存和運輸中控制腸炎沙門菌的生長提供理論參考依據，以快速有效地對食品微生物的安全性進行評估，同時為準確預測致病菌在食品介質中的生長狀態及參數提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養基及試劑

腸炎沙門菌（ATCC13076）于（4±0.5）℃冰箱中的大豆酪蛋白瓊脂（TSA）培養基上保藏；BPW 青島海博生物技術有限公司；氯化鈉（優級純）、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

THZ-103B型恒溫培養搖床、LRH-70型生化培養箱上海一恒科學儀器有限公司；移液槍（20～200 μL、1～5 mL） 德國Eppendorf公司；YXQ-LS-75S11型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SJ-CJ-1G型單人單面水平送風凈化工作臺上海尚凈儀器有限公司；UV-1600型紫外-可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同pH值和aw液體培養基的獲得

實驗用BPW液體培養基經高壓滅菌后，其pH值未發生顯著變化[16]，因此，培養基pH值的調節利用pH計，通過添加適量0.1 mol/L NaOH或HCl溶液調節到目標數值（表1）。培養基aw與其NaCl含量相對應[12]，分別為：0.997（質量分數0.5% NaCl）、0.987（質量分數2.5% NaCl）、0.980（質量分數3.5% NaCl）和0.976（質量分數4.5% NaCl），因此通過添加適量NaCl調節培養基aw，再將調節好的培養基分裝于不同錐形瓶中進行高壓滅菌，待用。

1.3.2 菌懸液的制備與接種

取保存于4 ℃冰箱中的腸炎沙門菌單菌落無菌操作接種于100 mL的BPW培養基中。于（37±1）℃、120 r/min搖床培養15 h，使菌體濃度達到穩定期（約109CFU/mL），用無菌BPW稀釋制成108CFU/mL的菌懸液以備用。根據菌種菌懸液的濃度，取100 μL菌種菌懸液接種到100 mL已根據實驗設計（表1）調節好pH值和aw的無菌BPW培養基中，使初始接種量為105CFU/mL。

1.3.3 因素水平設計

本實驗中采用的溫度、pH值和aw3因素的水平設計如表1所示，共進行33 組實驗。其中aw通過調節NaCl在培養基中的濃度達到目標值。

表1 溫度、pH值和aw因素水平設計Table1 Levels of temperature, pH and water activity

1.3.4 生長曲線觀測

本實驗采用比濁法，應用紫外分光光度計測量腸炎沙門菌在波長600 nm的濁度[13]，以無菌BPW培養基作為參照。開始培養前先測定每組接種后的培養液的OD值作為初始值，開始培養后，每隔一定時間吸取培養液，測定并記錄下OD值。

1.3.5 一級模型的建立

應用DMFit 3.5軟件（英國）擬合不同條件下腸炎沙門菌的生長曲線，獲得對應的最大比生長率（μmax），選用的Baranyi模型[17]見公式（1）～（3）：

式中：y0為最初培養液OD值；ymax為最終培養液OD值；μmax為最大比生長率/h-1；t為生長時間/h；L為遲滯期/h。

1.3.6 二級模型的建立

一般認為，溫度、pH值和aw對致病菌的影響是獨立的[18]?；诖耍罁礼amma概念，即假設每一個環境條件因子對生長率都有自己獨立的影響。通過分別研究溫度、pH值和aw的獨立影響從而建立腸炎沙門菌的CPM。

1.3.6.1 溫度的獨立影響

Rosso等[8]所建立的CPM相對于Ratkowsky提出的模型的優點在于其4 個參數都是有明確的生理學意義，并且可以避免由Ratkowsky模型中數學形式所導致的參數間產生結構相關性和增加參數估計的疑難程度等問題[19]。其關于溫度模型[5]見公式（4）：

式中：T為不同溫度/℃；Tmin和Tmax為預測的最低生長溫度和最高生長溫度/℃，即微生物沒有代謝活動時的溫度；Topt為最適生長溫度/℃。

已有文獻[20-22]報道，沙門菌已經被證明在4 ℃條件下無法生長，且Pin等[23]的研究中也表明腸炎沙門菌在4 ℃時的觀測值并沒有顯示代表性的失活趨勢，故取Tmin為4 ℃，以更好地獲得更加準確的腸炎沙門菌的生長參數。

1.3.6.2 pH值的獨立影響

描述pH值和微生物生長率的關系的基本pH值模型[9]見公式（5）：

式中：pHmin和pHmax為預測的最小生長pH值和最大生長pH值，即微生物沒有代謝活動時的pH值；pHopt為最適生長pH值。

1.3.6.3 aw的獨立影響

aw關于微生物生長率影響的模型[10]見公式（6）：

式中：aw為不同水分活度；aw（min）為預測的最小生長水分活度，即微生物沒有代謝活動時的水分活度；aw（opt）為最適生長水分活度。由于水分活度無法超越1，也就是純水，所以為了計算方便，取aw（max）為1，并且已證明了此取值不會影響到其他參數的數值變化[19]。

1.3.6.4 CPM的構建

二級模型是描述環境因子的變化如何影響一級模型中的參數[17]。腸炎沙門菌主參數值的確定，使用Origin 8.0軟件（美國OriginLab公司）中的非線性曲線擬合，進行基于最小二乘法迭代計算，使其殘差平方和達到最小。本研究采用Zwietering等[18]提出的修正Gamma方程描述3 個環境因子的獨立影響見公式（7）：

式中：μopt為最適條件下的最大比生長率/h-1。

1.3.7 CPM的可靠性評價

1.3.7.1 模型數學檢驗

Baranyi模型通過決定系數（determination of coefficient，R2）評價其擬合程度，對所建立的二級模型通過均方誤差（mean squared error，MSE）、偏差因子（bias factor，Bf）和準確因子（accuracy factor，Af）進行評價。

MSE是計算擬合數據和原始數據對應點的誤差平方和。MSE越接近于0，說明模型擬合的越好，數據預測越精確。表達式見公式（8）：

式中：μm為最大比生長率實驗觀測值/h-1；μp為最大比生長率預測值/h-1；n代表組數。

Af用于評價構建模型的準確程度，Af越大說明模型平均準確性越低，當其值為1時，說明觀測值與預測值完全吻合[24]。Bf能夠衡量觀測值與預測值之間存在的差距大小。當其值小于1時，表明平均預測值大于平均觀測值，反之則小于平均觀測值[24]。表達式見公式（9）、（10）：

式中：μ（m,i）為最大比生長率觀測值/h-1；μ（p,i）為最大比生長率預測值/h-1；m代表組數。

1.3.7.2 模型驗證

為了更好的檢驗構建的CPM的有效性，在設定的實驗條件溫度（30～42 ℃）、pH（6.6～8.0）、aw（0.976～0.997）范圍內，隨機選取3 組數據對模型進行拓展檢驗，相比固有檢驗，拓展檢驗能更客觀的評價模型的可靠性[25]。

2 結果與分析

2.1 一級生長模型的建立

Baranyi模型擬合的腸炎沙門菌典型生長曲線，如圖1所示。

圖1 Baranyi模型擬合的不同環境條件下的腸炎沙門菌的典型生長曲線Fig.1 Typical growth curves fi tted to Baranyi model of S. enteritis under different environmental conditions

由圖1可看出，擬合的生長曲線均呈現良好的S型，符合微生物的生長趨勢，并且在實驗范圍內，隨著溫度、pH值、aw越接近最佳生長條件，進入穩定期的時間越短，符合沙門菌的生長規律。

表2 用于擬合主參數模型的Baranyi模型的生長參數與決定系數Table2 Growth parameters and coefcients of determination by Baranyi model for CPM

表2 用于擬合主參數模型的Baranyi模型的生長參數與決定系數Table2 Growth parameters and coefcients of determination by Baranyi model for CPM

參數 μmax/h-1 R2溫度/℃ pH aw 30 6.6 0.997 0.0244 0.980 6.6 0.976 0.0226 0.953 7.2 0.997 0.0394 0.977 7.2 0.987 0.0271 0.951 7.2 0.976 0.037 0 0.987 7.5 0.997 0.050 0 0.994 8.0 0.997 0.0212 0.979 8.0 0.987 0.0213 0.974 8.0 0.976 0.0148 0.979 35 6.8 0.980 0.0213 0.994 6.6 0.987 0.0282 0.956 6.6 0.976 0.0228 0.954 8.0 0.987 0.0183 0.949 8.0 0.976 0.014 0 0.917 40 7.7 0.980 0.0147 0.950 37 42 6.6 0.997 0.0285 0.984 6.6 0.987 0.0186 0.916 6.6 0.976 0.039 0 0.965 7.2 0.997 0.022 0 0.967 7.2 0.987 0.0208 0.965 7.2 0.976 0.012 0 0.907 8.0 0.997 0.015 0 0.931 8.0 0.987 0.0163 0.943 8.0 0.976 0.0243 0.936

由表2可知，各組R2均在0.900以上，說明Baranyi模型能夠較好的擬合實驗中不同環境條件下腸炎沙門菌的生長情況。比較上述數據可以發現腸炎沙門菌最大比生長率隨溫度不同而發生顯著變化（如μmax（30 ℃）=0.037 0 h-1和μmax（42 ℃）=0.012 0 h-1），其次是pH值和aw。即溫度對腸炎沙門菌生長的影響最大，此結論符合金永國等[5]在關于沙門菌預測模型研究進展中所述溫度是食品在生產鏈中波動最大的因素的說法，并與趙楠[26]和Koutsoumanis[27]等分別在建立醬鹵肉中沙門菌的預測模型和建立鼠傷寒沙門菌不同溫度和aw界限模型的研究中所述溫度對微生物生長的影響最大的結論相一致。

2.2 CPM的建立

通過Origin 8.0軟件進行二級模型擬合，得到腸炎沙門菌溫度、pH值和awCPM的參數值見表3所示，擬合得到的溫度、pH值、aw的CPM，如圖2所示。

表3 腸炎沙門菌溫度、pH值和aw的CPM參數值Table3 Parameters of CPM for the effects of temperature, pH and aw

由表3可知，腸炎沙門菌的最適生長溫度為34.24 ℃，與沙門菌的生長規律相一致[1]。最適生長水分活度（aw（opt））為0.997，與Dimakopoulou-Papazoglou等[12]的研究中求得的沙門菌aw（opt）0.994很接近，最小生長水分活度（aw（min））0.957，也與Pin等[23]的研究中通過平方根模型求出的aw（min）0.947接近。求得的最適生長pH值（pHopt）7.55，在文獻[28]中所述培養基中沙門菌的pHopt值為6.8～7.8的范圍內。擬合獲得的腸炎沙門菌相關參數值，符合上述關于沙門菌生物學特性的描述。此外，擬合得到的溫度、pH值、aw主參數模型的MSE較小（小于0.001），說明誤差較小，Af接近1，表明預測模型與實際觀測相吻合。

圖2 腸炎沙門菌溫度（a）、pH值（b）和aw（c）的CPMFig.2 CPM curves for the effects of temperature (a), pH value (b) and aw (c)

由圖2可知，腸炎沙門菌的CPM，均呈現良好的擬合效果。溫度的CPM曲線（圖2a）與Akkermans等[29]關于新型溫度、pH值作用模型的研究中得到的溫度CPM曲線圖呈現相同的趨勢。但相比于溫度和aw的CPM，pH值CPM的數據點稍顯離散，但其和aw的CPM的曲線也分別與Dimakopoulou-Papazoglou等[12]關于腸炎沙門菌生物膜的pH值和aw模型構建研究中得到的模型擬合曲線圖像趨勢一致，即在實驗范圍內，μmax隨著溫度、pH值和aw的增加而增大，但超過某一臨界值（最佳值）時，μmax開始迅速降低，同時也顯示出沙門菌對該條件變化的敏感程度。

2.3 CPM的可靠性評價

將實驗范圍內的隨機選取的7 組實驗，代入已構建的腸炎沙門菌的CPM中，計算得到最大比生長率預測值與實驗得到的觀測值進行比較，如表4所示。

表4 用于驗證腸炎沙門菌最大比生長率CPM的實測值與預測值Table4 Observed and predicted maximum specif i c growth rates of S. enteritis by CPM for validation on different growth environments

由表4可以看出，一級模型R2大于0.900表明通過Baranyi模型擬合獲得的最大比生長率具有較高的擬合度，此外，CPM的預測值與實測值均比較接近（差值＜0.01 h-1），說明本實驗構建的腸炎沙門菌CPM具有較高的擬合效果。

表5 腸炎沙門菌CPM的數學檢驗值Table5 Mathematical test values of S. enteritis by CPM

一般認為Bf為0.70～0.90或者1.06～1.15范圍內說明該模型是可以被接受的[30]，由表5可知，CPM固有檢驗求得的Bf（1.021）和由隨機組求得的拓展檢驗的Bf（0.963）均在較好范圍內。對于Af固有檢驗和拓展檢驗稍大于1，但也在可接受范圍內。此外，用于檢驗模型擬合度的參數MSE均較小，說明構建的模型準確性較高，能夠較好地預測腸炎沙門菌的生長情況。

3 結論與討論

本實驗選用了3 種環境因素建立的腸炎沙門菌CPM，獲得了腸炎沙門菌在BPW培養基中主參數值分別為：Tmax44.51 ℃、Topt34.24 ℃、pHmax8.14、pHmin6.09、pHopt7.55、aw（min）0.957和aw（opt）0.997，符合腸炎沙門菌的基本生長規律。固有檢驗和拓展檢驗結果，驗證CPM得到的MSE分別為1.153×10-5和2.311×10-5、Bf為1.021和0.963以及Af為1.154和1.267均在可接受范圍內，表明構建的模型表明模型具有良好的擬合度，可用于預測腸炎沙門菌的生長。

國內外已經建立了大量不同食物中的沙門菌在溫度與pH值、溫度與aw等2 種環境因素影響下生長模型以及預測模型[12,22]。本實驗得到的腸炎沙門菌的主參數值和已有的文獻[12,23,31]結論類似，且均在合理的腸炎沙門菌生長范圍內。但本研究求得腸炎沙門菌的主參數值與部分已有的研究結果有一定差異，Dimakopoulou-Papazoglou等[12]在pH值和aw對沙門菌生物膜形成的影響的研究中得到pH值主參數值分別為pHmin3.58、pHopt9.71和pHmax6.02。此外Lianou等[32]在建立腸炎沙門菌整合不同pH值和aw的應變率模型所求得的最小生長pHmin3.99，也與本研究有一定差異（pHmin6.09）。造成這種差異的原因可能有實驗過程中試劑和實驗參數、方法的選擇以及實驗環境因素的交互作用等。例如Dimakopoulou-Papazoglou等[12]是利用基于結晶紫染色法在微量滴定板孔中進行生物膜光密度的測量（OD580nm），并通過引入了相對生物膜形成指數，作為對pH值和aw對生物膜形成影響的量化指標，此外研究選用的液體培養基的不同可能也是造成結果不同的原因之一。Lianou等[32]則研究腸炎沙門菌菌株變異性并通過累積概率分布作為生長模型的輸入用于了建模過程。本研究通過數學檢驗以及隨機驗證實驗，表明構建的CPM能夠很好地預測腸炎沙門菌的生長，可為以后腸炎沙門菌的監控預防和食品安全保證提供參考與理論依據，同時為研究致病菌在食品介質中的生長狀態及參數提供了新思路，以減少由致病菌引發的食品安全風險。