1 株攜帶mcr-1的食品動物源多藥耐藥奇異變形桿菌耐藥性狀分析

張德福，安 慧，張 健，趙禹宗，張 蕊，劉雪飛，楊立娜，白鳳翎，李 春，周冬生，李鈺金，殷 喆，勵建榮,*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧省食品安全重點實驗室，遼寧省高等學校生鮮食品產業技術研究院，遼寧 錦州 121013；2.軍事科學院軍事醫學研究院微生物流行病研究所，病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071；3.渤海大學數理學院，遼寧 錦州 121013；4.榮成泰祥食品股份有限公司，山東 榮成 264309）

耐藥細菌的出現是21世紀人類健康面臨的最嚴峻的挑戰之一，而食物鏈在人接觸耐藥細菌的途徑中居重要地位[1-3]，如人類大多數耐藥沙門菌感染就是因為食用了污染的動物性食品而引起的[3-7]。在美國，每年可能有一百萬起食源性沙門菌喹諾酮耐藥性病例，其中有上千起死亡病例，幾乎都源于動物性食品[8]。人和動物的腸道是耐藥菌的儲存庫，而且由于畜禽集約化養殖的迅猛發展，畜禽糞便經常沒有任何凈化處理任意排放，污染了土壤和水源[3,7,9-10]；糞便經雨水沖刷、地表徑流等最終進入湖泊和海洋[11-12]，造成蔬菜[13-14]、水產品[13,15-18]、畜禽等動物性食品[6,9,19]及地下水[7,10-11]等出現耐藥菌。耐藥菌最終通過被污染的作物、耐藥菌感染的畜禽肉和蔬菜、暴露在耐藥菌污染的水中的水產品等途徑進入人體，從而引起人類的感染及耐藥菌株的傳播[3]。

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）是腸桿菌科、變形桿菌屬的一種革蘭氏陰性條件致病菌，廣泛存在于水、土壤、腐敗的有機物以及人和動物的腸道中，與臨床關系較密切，能夠引起慢性中耳炎、創傷感染等繼發感染，也可引起膀胱炎、嬰兒腹瀉、食物中毒等，是僅次于大腸埃希菌的可引起泌尿系統感染的主要病原菌[20]。奇異變形桿菌主要污染動物性食品，特別是肉類，受污染的食品在一定條件下會引起人的感染。我國公布的細菌性食物中毒病原中，奇異變形桿菌僅次于副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、沙門菌（Salmonella）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），是引起食物中毒的第四大主要病原菌[21]。

多黏菌素是從多黏桿菌培養液中提取的一種多肽類抗菌藥物，主要為多黏菌素B和多黏菌素E（黏菌素）兩種。由于多黏菌素具有腎毒性和神經毒性及廣譜抗菌藥物的研發與使用，在臨床上已較少使用；但是由于20世紀90年代末多藥耐藥革蘭氏陰性菌的出現，尤其是耐碳青霉烯類腸桿菌的出現，多黏菌素又被重新應用于這類細菌的治療，并被視為對抗多藥耐藥革蘭氏陰性細菌感染的最后一道防線[22]。因此，多黏菌素耐藥問題受到了國際上的廣泛關注。2015年11月，華南農業大學劉健華教授和中國農業大學沈建忠院士的團隊首次從豬體內分離得到一株對黏菌素耐藥的大腸桿菌SHP45，進而報道了腸桿菌科細菌質粒介導的多黏菌素耐藥基因mcr-1對多黏菌素的耐藥機理，該基因是國際上首次發現的質粒介導的黏菌素耐藥基因[23]。mcr-1耐藥基因多出現在大腸埃希菌中，此外，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）、陰溝腸桿菌（E. cloacae）、沙門菌（Salmonella）、克呂沃菌（Kluyvera ascorbata）、阪崎克羅諾桿菌（Cronobacter sakazakii）等腸桿菌科細菌也有關于mcr-1耐藥基因的報道[22]，但尚鮮有研究表明奇異變形桿菌攜帶mcr-1耐藥基因的研究報道。本課題組在對遼寧錦州附近的養雞場、養豬場、屠宰場等地的食品動物源性多藥耐藥菌的調查中，在某養雞場分離得到一株攜帶mcr-1等耐藥基因的廣泛耐藥分離株F160211，經鑒定為奇異變形桿菌，并對該菌的耐藥譜、耐藥基因、攜帶耐藥基因的質粒復制類型等進行了進一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥康凱（MacConkey，MAC）瓊脂培養基、伊紅美藍（eosin methylene blue，EMB）瓊脂培養基、牛腦心浸液（bovine brain heart infusion，BHI）培養基、Mueller-Hinton肉湯（MH）瓊脂培養基 美國BD公司；革蘭氏陰性需氧菌藥敏檢測板 上海星佰生物技術有限公司；Taq-聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix、細菌基因組DNA提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；瓊脂糖 美國Sigma公司；Goldview核酸染料 北京博邁德公司；2000 DNA Marker 北京鴻躍公司；甘油 美國MP Biomedicals公司；所有引物全部由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

藥敏紙片：頭孢唑啉（30 μg/片）、頭孢他啶（10 μg/片）、亞胺培南（10 μg/片）、環丙沙星（5 μg/片）、阿米卡星（30 μg/片）、阿奇霉素（15 μ g/片）、四環素（1 0 μ g/片）、磷霉素（200 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、復方新諾明（25 μg/片）、替加環素（15 μg/片）和多黏菌素E（10 μg/片） 英國Oxoid公司。

1.2 儀器與設備

DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠；LRH系列生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；Mastercycler pro梯度PCR儀、5424R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Cheimd Doc XRS型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司；NanoDrop 2000微量分光光度計、II級生物安全柜、紙片分配器 美國Thermo公司；比濁儀 法國梅里埃公司；HWS恒溫恒濕培養箱 寧波市科技園區新江南儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌的分離與純化

自養雞場采集病雞、自屠宰場采集血液樣品、自養豬場用棉簽蘸取糞便（或者肛門拭子）和鼻拭樣品，樣品放入采樣管或采樣袋中，編號后放入冰盒內帶回實驗室。將病雞解剖后取發病部位組織約50 g，勻漿后取20 μL涂布MAC瓊脂平板，豬糞便直接涂板，抗凝血取100 μL涂板。平板37 ℃培養過夜后挑取單克隆劃線接種至EMB瓊脂平板上37 ℃培養24 h，再挑單克隆菌落涂布BHI瓊脂平板上37 ℃培養12 h左右，刮下菌苔，置于含30%甘油的BHI肉湯中-80℃保存備用。上述培養基均添加200 μg/mL氨芐西林。

1.3.2 細菌DNA模板的制備

根據細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，稀釋至質量濃度為10 ng/μL備用。

1.3.3 16S rRNA基因擴增

以保存的細菌基因組DNA為模板，以參考文獻[24]中的27F/1492R引物和反應條件擴增細菌16S rRNA基因。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶大小無誤后送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.4 紙片擴散法鑒定耐藥譜

參照美國臨床和實驗室標準協會推薦方法[25]及SN/T 1944—2016 《動物及其制品中細菌耐藥性的測定 紙片擴散法》鑒定細菌的耐藥譜。

1.3.5 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定

采用肉湯稀釋法，根據試劑盒說明書，挑取單克隆菌落用0.45%滅菌的生理鹽水2～3 mL配制成0.5麥氏濁度的菌懸液后取60 μL加入12 mL BHI培養基搖勻，加入至革蘭氏陰性需氧菌藥敏檢測板中，放置37 ℃恒溫培養16～20 h觀察結果。

1.3.6 耐藥基因篩查

以實驗室建立的方法，用PCR篩查超廣譜β-內酰胺酶、碳青霉烯酶和喹諾酮類、大環內酯類、多黏菌素類等常見抗菌藥物的耐藥基因。超廣譜β-內酰胺酶、碳青霉烯酶擴增引物等見參考文獻[26]，其他引物序列與退火溫度等見表1。

表1 耐藥基因篩查用引物Table1 Primers used for drug-resistant gene screening

續表1

1.3.7 質粒復制類型分析

根據p H N S H P4 5序列（G e n B a n k登錄號：KP347127）的復制起始蛋白基因repA和質粒分離蛋白parA基因設計引物進行擴增，檢測攜帶mcr-1的質粒復制類型。PCR程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；最終72 ℃延伸5 min。引物序列見表2。

表2 質粒復制類型PCR檢測用引物Table2 Primers used for detection of plasmid replicon type

2 結果與分析

2.1 細菌的分離與純化

課題組在遼寧省內多家養雞場、養豬場、屠宰場等共采集樣品500余份，分離到多藥耐藥菌361 株，其中一株編號為F160211的菌株初步鑒定為對多黏菌素等藥物耐藥，因此進行了進一步的研究。

2.2 16S rRNA菌種擴增結果

以細菌F160211的基因組DNA為模板，以27F/1492R引物擴增16S rRNA基因后的測序結果進行BLAST分析表明，分離株F160211為奇異變形桿菌。

2.3 紙片擴散法鑒定耐藥譜

紙片擴散法對奇異變形桿菌F160211的耐藥譜鑒定表明（表3），該菌對頭孢唑啉、頭孢他啶、環丙沙星、阿米卡星、阿奇霉素、四環素、磷霉素、氯霉素、復方新諾明和多黏菌素耐藥，對亞胺培南和替加環素敏感。

表3 紙片擴散法鑒定奇異變形桿菌F160211耐藥譜Table3 Drug-resistance pro fi le of P. mirabilis F160211 using disk-based test

2.4 肉湯稀釋法測MIC結果

表4 奇異變形桿菌F160211的MICTable4 MIC of P. mirabilis F160211

利用肉湯稀釋法對奇異變形桿菌F160211的耐藥情況進一步詳細分析（表4），結果表明，該菌對青霉素類、第1代和第2代頭孢菌素類、大環內酯類、氨基糖苷類、酰胺醇類、四環素類、磺胺類、利福霉素類和黏菌素類等耐藥，對呋喃類、多肽類、喹諾酮類中介耐藥，對第3代和第4代頭孢菌素類、單環β-內酰胺類、碳青霉烯類、甘氨酰環素類敏感。

2.5 耐藥基因篩查結果

以文獻報道的、實驗室已合成的多種耐藥基因引物對奇異變形桿菌F160211的基因組DNA進行PCR擴增，結果表明，F160211攜帶blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaTEM、blaOXA-1、mph(A)、qnrS和mcr-1等多種耐藥基因（圖1）。

圖1 奇異變形桿菌F160211耐藥基因PCR篩查Fig.1 PCR screening of drug-resistance genes from P. mirabilis F160211

2.6 質粒復制類型分析

通過對奇異變形桿菌F160211攜帶mcr-1基因的質粒repA和parA基因進行PCR驗證結果表明，養殖場分離得到的分離株奇異變形桿菌F160211的mcr-1基因存在于pHNSHP45類似的IncI2型質粒上（圖2）。

圖2 質粒復制類型PCR檢測結果Fig.2 PCR detection of plasmid replicon type

3 討 論

MIC和耐藥基因PCR擴增結果表明，分離自病雞肉中的奇異變形桿菌F160211為多藥耐藥株，攜帶有多種耐藥基因，耐藥性非常嚴重，除了對第3代和第4代頭孢菌素類、單環β-內酰胺類、碳青霉烯類、甘氨酰環素類敏感外，對其他藥物均為耐藥或中介耐藥；且其耐藥基因位于質粒上，具有水平轉移給其他細菌并播散開來的風險，給消費者的食品安全和身體健康帶來隱患。

多黏菌素對大多數革蘭氏陰性菌具有較好的殺菌作用，一直被養殖業者廣泛應用于促進動物生長和疾病的預治等；在臨床上用作對碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌等革蘭氏陰性多藥耐藥菌治療的最后一道防線；雖然也有耐藥菌出現，但一般都是染色體介導的，其耐藥基因的傳播也是通過病人之間的克隆株的傳播，耐藥率較低，危害較小[35]。但Liu Yiyun等[23]在雞、豬、零售的肉類和病人體內發現了質粒攜帶的、可在細菌間接合轉移的多黏菌素耐藥基因mcr-1，且該質粒在雞肉中存在的比例高達28%，引起世界范圍的震驚。

本研究中，奇異變形桿菌F160211攜帶有mcr-1耐藥基因，但其耐藥性為敏感，這也與Liu Yiyun[23]、易靈嫻[22]、Skov[36]等報道mcr-1介導宿主菌低水平的黏菌素耐藥相符；攜帶mcr-1的奇異變形桿菌質粒與Liu Yiyun等[23]報道的屬于同一類型不相容性質粒，宿主范圍也由報道的大腸桿菌、沙門菌等進一步擴大至奇異變形桿菌，這說明該質粒已在不同菌種間發生了水平轉移，形勢更加嚴峻。隨著時間的推移，如果沒有合理的應對措施，將可能有更多的菌種產生mcr-1耐藥基因，這無論對食品安全還是臨床感染的治療都將是嚴峻的挑戰，同時也對人類濫用抗菌藥物的行為敲響了警鐘。