產β-葡萄糖苷酶酵母菌的分離鑒定及其在人參皂苷Rg3轉化中的應用

蘇 敏，樸春紅,*，梁德春*，初 琦，王玉華，王 尚，陳 月，胡 洋，霍 越

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.韓國慶熙大學人參資源中心，韓國 京畿道水源 449-701）

人參皂苷是人參（Panax ginseng C. A. Mey. entum）中主要生物活性成分之一，屬于四環三萜皂苷，結構上由苷元與糖連接而成，由于苷元結構類型、糖基的數量和位置的不同，其性質和功能具有很大差異[1]。將人參中含量豐富的人參皂苷（Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1、Rf等）轉化為藥用價值更高、腸道吸收功能更強的稀有人參皂苷（Rh1、Rh2、F1、F2、Rg3、Rb3、Rh2、compound K等）成為現代研究的重點之一[2]，其中稀有人參皂苷Rg3具有抑制腫瘤細胞增殖、浸潤、轉移作用，抑制胃癌誘導的血管內皮細胞增殖作用等備受關注[3]。然而自然生長的人參中人參皂苷Rg3含量極少[4]，可以通過化學法、酶法和微生物法達到轉化的目的。微生物法轉化原理主要在于微生物所分泌的β-葡萄糖苷酶為主的酶系對人參皂苷進行轉化。人參皂苷Rb1與人參皂苷Rg3相比，只在C-20位上多出2 個葡萄糖基[5]，利用β-葡萄糖苷酶轉移葡萄糖基的作用[6]，可以將人參皂苷Rb1轉化為人參皂苷Rg3（圖1）[7]。邵巍等[8]研究利用β-葡萄糖苷酶將人參皂苷Rb1的C-21位2 個—GLc鍵水解，進而轉化為稀有人參皂苷Rg3；閆炳雄等[9]研究發現經黑曲霉發酵人參后，也可生成人參皂苷Rg3，并得到較好的轉化效果。

圖1 人參皂苷Rg3轉化途徑[7]Fig.1 Transformation pathway of ginsenoside Rg3

kefir粒是一種多菌種共生的可食用微生物資源，研究表明kefir粒發酵液中含有β-葡萄糖苷酶在內的豐富酶系[10-11]，其中β-葡萄糖苷酶是轉化人參皂苷的重要酶之一[12-13]，但目前利用kefir粒發酵人參的研究鮮有報道。本項目組利用kefir粒發酵全組分人參漿，研究發現其香氣成分發生明顯變化，人參感官品質得到顯著改善，人參總皂苷含量也得以提高[14]，本實驗采用改良七葉苷瓊脂糖培養基，從kef i r粒發酵人參漿中分離出β-葡萄糖苷酶菌株，并優化該菌株發酵人參轉化稀有人參皂苷Rg3的發酵工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參（4 a生）產于吉林省汪清縣；kefir粒為本實驗室保存菌種；伊利純牛乳 市售。

人參皂苷Rb1（140518）、Rd（CAS號：52705-93-8）、Rg3（CAS號：14197-60-5）（純度≥98%） 南京景竹生物有限公司；硅膠60薄層板 德國Merk公司；Taq DNA聚合酶、Ezup柱式酵母基因組DNA抽提試劑盒、DNA Ladder Mix marker 生工生物工程（上海）股份有限公司；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-20AT高效液相色譜儀、CS-9301PC薄層掃描儀日本島津公司；AppLied Biosystems 3730XLDNA電泳槽、DYCP-31DN穩壓電泳儀 北京六一儀器廠；DYY-5電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司；DK-8D凝膠成像儀 上海復日科技儀器有限公司；FR980恒溫培養箱 太倉市科教器材廠；DHP-9162恒溫搖床 太倉市實驗設備廠。

1.3 方法

1.3.1 培養基制備

改良七葉苷瓊脂糖培養基的配制參照宋欣等[15]的方法改良，配方為1 g七葉苷、0.5 g檸檬酸鐵、2 g酵母膏、0.5 g蛋白胨、20 g瓊脂，經121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min；種子培養基配方為10 g酵母粉、20 g蛋白胨、20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水、調至pH 6.0、經121 ℃高壓蒸氣滅菌20 min；人參漿制備方法為挑選無病蟲害的完整鮮人參，清洗干凈，蒸制20 min，按照人參-水質量比1∶2、5 000 r/min多次點動共計3 min打漿，110 ℃滅菌20 min。

1.3.2 產β-葡萄糖苷酶菌株的篩選與鑒定

形態結構鑒定：kefir粒在28 ℃條件下發酵人參漿48 h后，將其按10-3、10-4、10-5、10-64 個梯度稀釋，各取50 μL菌液均勻涂布于改良七葉苷培養基，25 ℃培養48 h，菌落周圍出現黑色的水解斑則為產β-葡萄糖苷酶菌株[16]。

分子鑒定方法：26S rDNA D1/D2區的序列分析是按照Jespersen[17]和Baleiras[18]等的方法。待測菌株DNA提取采用SK8257試劑盒操作；使用引物為NL1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物和序列測定，所得菌株DNA序列信息在NCBI上BLAST比對分析。PCR反應體系（25 μL）：包括基因組DNA（20～50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（含有Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL、上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，加雙蒸水至25 μL；PCR反應程序：94 ℃預變性4 min、94 ℃延伸45 s；55 ℃延伸45 s；72 ℃延伸1 min；30 個循環；72 ℃修復延伸10 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條件為150 V、100 mA、20 min，使用凝膠成像儀觀察結果。

1.3.3 人參漿全組分的發酵

將全人參培養基以5 mL/100 g的接種量接種107CFU/mL的馬克斯克魯維酵母菌，28 ℃培養48 h。由于本研究策略是盡可能不加大體系體積的前提下，提高稀有人參皂苷的含量，且前期實驗表明搖床培養和靜置培養對Rg3的含量變化不顯著，因此實驗采用靜置培養。同等培養條件下加入相等體積的無菌水作為未發酵人參空白對照組。發酵結束后立即冷凍，隨后使用真空冷凍進行干燥，干燥后將樣品真空包裝，-4 ℃儲存備用[19]。

1.3.4 全組分發酵人參漿中總人參皂苷的提取

取發酵人參漿凍干粉末1 g，利用索氏提取法，三氯甲烷加熱回流3 h后，棄去三氯甲烷，揮干溶劑，移入100 mL錐形瓶中，加入50 mL飽和正丁醇，靜置過夜后，超聲處理（功率250 W，頻率50 Hz）30 min，過濾后取濾液25 mL，置于蒸發皿中蒸干，干燥物中加入少量甲醇溶液完全溶解后轉入5 mL容量瓶定容后用于檢測[20]。將各人參皂苷標品溶于100%甲醇中制得0.2 mg/mL溶液用于皂苷的分析[21]。

1.3.5 人參皂苷的測定

1.3.5.1 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法

將1.3.4節中的總人參皂苷提取液用0.22 μm微孔濾膜過濾后，利用HPLC進行分析。分析條件：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；進樣量10 μL；流速1 mL/min；流動相A為5%磷酸溶液、B為乙腈，洗脫條件是0～45 min，33% B；45～80 min，49% B；檢測波長為203 nm[22]。

1.3.5.2 薄層層析（thin layer chromatography，TLC）法

將人參皂苷點樣于TLC硅膠板上，展開劑為氯仿-甲醇-水（10∶5∶1，V/V）[23]，噴20%硫酸-乙醇溶液后于110 ℃顯色5 min。用薄層掃描儀掃描其灰度，按下式計算皂苷轉化率：

式中：A為未發酵樣品灰分質量；B為發酵后樣品灰分質量。

1.3.6 單因素試驗

考察人參-水質量比、pH值、接種量、發酵時間對轉化人參皂苷Rg3含量的影響。人參皂苷Rg3含量表示1 g人參干質量含有的稀有人參皂苷Rg3含量。以轉化人參皂苷Rg3含量為考核指標，確定各單因素試驗合適的發酵條件，為轉化人參皂苷Rg3的條件優化提供參考范圍，試驗設計設置3 個平行。

1.3.7 響應面試驗

篩選得到的菌株轉化人參皂苷Rg3單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken設計試驗因素與水平（表1），試驗結果用Design Expert 8.1分析，確定各因素及因素之間的交互作用對人參皂苷Rg3含量的影響，優化其工藝條件[24]。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.4 數據處理與統計

采用MEGA5.0構建系統發育樹，采用Design Expert 8.1響應面優化設計。數據以 ±s表示，采用Microsoft Excel 2010處理數據，用GraphPad Prism5.0制圖，應用SPSS 17.0統計分析數據，組間比較采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 kef i r粒發酵人參液中稀有人參皂苷Rg3含量的變化

HPLC法分析人參稀有皂苷發現人參皂苷Rg3保留時間與Rh2、compound K的基本一致，紫外檢測器條件下無法精確分析其變化。因此將HPLC法與TLC法相結合分析人參漿中人參皂苷Rg3的轉化情況。人參皂苷Rg3有多種轉化途徑，其中一條轉化途徑為人參皂苷Rb1→Rd→Rg3[25]。本實驗測定5%接種量kef i r粒發酵人參漿，28 ℃培養3 d后，發酵人參漿中人參皂苷Rb1、Rd和Rg3變化結果如表2所示。kef i r粒發酵后大大增加了Rg3的含量，稀有皂苷Rg3提高了134.7%。同時，發酵人參中人參皂苷Rb1比未發酵組降低了41.3%，人參皂苷Rd提高了104.5%。因此可以推測，kefir粒發酵人參轉化人參皂苷Rg3可能的轉化途徑為Rb1→Rd→Rg3，研究表明β-葡萄糖苷酶在該轉化途徑中起重要作用[19]。

表2 ke fi r粒發酵人參皂苷含量Table2 Ginsenoside content in ke fi r fermented ginseng mg/g

2.2 產β-葡萄糖苷酶菌種的篩選

kefir粒發酵人參菌液涂布于改良七葉苷培養基上培養36 h后，篩選出產黑色水解斑的菌株C21（圖2A），判斷其為產β-葡萄糖苷酶的菌種。在七葉苷培養基中產黑色水解斑的菌落，進行形態結構鑒定，挑取單一菌落經反復劃線分離得純培養，制片、革蘭氏染色、電子顯微鏡下觀察其形態。形態相似，菌株在固體種子培養基中呈乳白色、平滑、不透明，表面光滑，菌落易挑起（圖2B）。顯微鏡（×100）下觀察形態結果如圖2C所示，初步鑒定結果為一株酵母菌，進一步對其進行分子鑒定。

圖2 產β-葡萄糖苷酶菌菌株的培養形態與形態特征Fig.2 Colony morphology and cultural characteristics of the strain capable of producing β-glucosaccharase on agar plate

2.3 產β-葡萄糖苷酶菌株分子鑒定

利用NL1和NL4一對引物擴增待測菌株26S rDNA近5’端D1/D2區域，擴增結果見圖3。由圖3可知，擴增產物經電泳檢測出現578 bp熒光條帶，與預期結果一致，片段大小與已報道的片段（500～600 bp）相符[15]。將待測菌株的D1/D2區域測序，在GenBank中進行同源性序列搜索（BLAST Search），結果顯示待測菌株與馬克斯克魯維酵母序列相比，同源性高達99%（圖4），因此進一步驗證待測菌株為馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）。該菌種是克魯維酵母屬中非常重要的一個菌種，因其耐高溫、生長速率快且安全性高等諸多優勢而應用于如酶類、乙醇等工業生物技術領域[26]。王和平[27]和曾爽[28]等從kefir粒分離鑒定出馬克斯克魯維酵母菌，鐘浩等[12]從6 種不同來源的kefir粒分離的4 種菌種中也含有馬克斯克魯維酵母，與本研究的結果一致。微生物轉化人參皂苷反應機制一般認為是微生物產生的酶水解人參皂苷中的糖基，從而引起結構的改變而得到稀有皂苷，如人參皂苷Rg3。目前研究結果表明，微生物轉化Rg3的酶主要為β-葡萄糖苷酶[29]，而利用微生物產β-葡萄糖苷酶應用于人參皂苷轉化的研究多數為黑曲霉等真菌。因黑曲霉菌株的產酶活性會隨著保存時間的延長而降低，不利于儲存[30]，在食品加工中的應用受到限制。近年來，許多學者關注于研究篩選產β-葡萄糖苷酶的食品級安全菌種。如金清等[31]研究從辣白菜、四川泡菜等蔬菜發酵篩選乳酸菌，史學偉等[32]研究從新疆特色葡萄中篩選產β-葡萄糖苷酶酵母菌等。kef i r粒中含有多種乳酸菌和酵母菌等微生物，但是kefir粒發酵全組分人參時，發現產β-葡萄糖苷酶的微生物為馬克斯克魯維酵母。馬克斯克魯維酵母適應性強，可以推測kefir粒發酵人參中馬克斯克魯維酵母成為優勢菌種，抑制了乳酸菌的生長。將該菌株保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏編號為13907。

圖3 待測菌株（C21）26S rDNA D1/D2區域的PCRFig.3 PCR of the 26S rDNA D1/D2 region of the strain (C21)

圖4 依據26S rDNA序列的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 26S rDNA sequences constructed by neighbor-joining method

2.4 馬克斯克魯維酵母發酵人參提高人參皂苷Rg3工藝優化

2.4.1 單因素試驗結果

圖5 人參-水質量比、pH值、接種量和發酵時間對人參皂苷Rg3含量的影響Fig.5 Effects of ginseng-to-water ratio, pH value, inoculumconcentration, and fermentation time on the content of ginsenoside Rg3

由圖5可知，人參-水質量比在1∶2.0～1∶2.6范圍內，隨著水比例的增加，人參皂苷Rg3含量呈現上升趨勢，當人參-水質量比為1∶2.6時人參皂苷含量達到最大值為（3.22±0.18）mg/g，隨后人參皂苷Rg3含量趨于穩定。在pH值范圍為4.5～6.5范圍內，隨著pH值的增加，人參皂苷Rg3的含量呈現先上升再下降的趨勢，當pH值為5.5時，人參皂苷Rg3的產量達到最大值為（2.36±0.23）mg/g。考察馬克斯克魯維酵母接種量對稀有皂苷轉化率的影響中發現，隨著接種量的增加，人參皂苷Rg3的含量呈現先增加后減少的趨勢，當接種量為3%時，人參皂苷含量達到最高值為（3.02±0.25）mg/g，隨后人參皂苷Rg3的含量有所下降，這可能是由于酵母菌的積累所產生的次級代謝產物將人參皂苷Rg3轉化成其他皂苷。在發酵時間1～9 d內，隨著發酵時間延長，人參皂苷Rg3含量呈現先上升后下降的趨勢，且呈階梯狀下降，當發酵時間3 d時，人參皂苷Rg3的含量達到最大值為（3.13±0.11）mg/g。結果顯示，人參-水質量比、pH值、接種量和發酵時間對轉化Rg3影響顯著。但是所有試驗組的人參漿pH值范圍保持在5.5～6.0左右，從成本和工業化生產角度出發，選擇人參-水質量比、接種量和發酵時間進行響應面試驗分析。

2.4.2 響應面試驗結果與方差分析

根據Box-Behnken試驗設計原理，綜合單因素試驗結果，進行3因素3水平響應面試驗，結果如表3所示，方差分析結果見表4。

表3 響應面試驗設計及結果Table3 Experimental design and results for response surface analysis

對上述試驗結果進行二次回歸擬合，建立的回歸方程為Y=3.40+0.26A-0.099B-0.024C+0.30AB+0.055AC-0.33BC-0.50A2-0.39B2+0.24C2。

表4 方差分析結果Table4 Analysis of variance for quadric regression model

從表4可得出，整體模型的F值為78.44（P＜0.000 1），表明試驗所采用二次回歸方程模型極顯著，在統計學上是有意義的。本試驗失擬項P值為0.220 3大于0.05，對模型有利，無失擬因素存在。該模型方程決定系數R2值為0.977 6，說明回歸方程擬合程度良好，自變量與響應面之間線性關系顯著，可用于人參皂苷Rg3含量檢測試驗的理論預測[24]。對比影響人參皂苷Rg3含量的主次因素為人參-水質量比（A）＞接種量（B）＞發酵時間（C）。

圖6 Box-Behnken試驗模型響應面圖和等高線圖Fig.6 Rsponse surface and contour plots

由圖6可以看出，對人參-水質量比、接種量和發酵時間3 個因素交互作用分析，得到交互因素的響應面圖，等高線圖均為橢圓形，響應面三維圖均有穩定點，且為極大值。結果顯示人參-水質量比和酵母接種量、酵母接種量和發酵時間均具有交互性（P＜0.05），人參-水質量比和發酵時間的交互作用不顯著（P＞0.05）。通過數據處理分析可知，優化的發酵條件為人參-水質量比1∶2.65、發酵時間3 d、接種量2.94%，人參皂苷Rg3含量最大預測值為3.3298 mg/g。為檢驗模型的準確性，采用優化后最佳發酵條件進行發酵驗證實驗，3 次實驗得到人參皂苷Rg3含量平均值為（3.31±0.04）mg/g。預測值與實際值接近，說明該回歸模型優化的發酵工藝是有效的。

眾多學者致力于微生物發酵轉化人參皂苷的研究[1,2,15]，得到了較好的結果。江波等[33]研究發現，馬克斯克魯維酵母分泌的酶具有糖基轉移的活性，能促進人參皂苷的形成。本實驗研究kefir粒以及首次探索從kefir粒分離得到的產β-葡萄糖苷酶菌株發酵全組分人參，發現均能顯著提高人參皂苷Rg3含量，經優化發酵工藝后人參皂苷Rg3含量與未發酵人參中人參皂苷Rg3相比提高了3.48 倍，高于陳旸等[34]研究的2.3 倍和吳迪等[35]研究的轉化率44%。更值得關注的是，馬克斯克魯維酵母發酵人參后產生特殊的香氣，給人們一種非常愉悅的感受。本課題組對kefir粒發酵人參后香氣成分進行分析，發現發酵后的人參增加了果香味和燒烤香味，同時降低其不良風味[14]。人參進入新資源食品原料庫后，除人參皂苷含量外，人參的感官品質也成為重要的食品加工因素。運用微生物法發酵改善人參風味有希望成為開發人參高價值食品的有效途徑。

3 結 論

本實驗從kefir粒發酵人參漿中篩選出產β-葡萄糖苷酶的菌株，經鑒定為馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）。通過Box-Behnken試驗設計優化馬克斯克魯維酵母轉化生產人參皂苷Rg3工藝，優化后的工藝為人參-水質量比1∶2.65、發酵時間3 d、馬克斯克魯維酵母接種量2.94%，該條件下人參皂苷Rg3含量為（3.31±0.04）mg/g，轉化率為248%，比優化之前提高了1.84 倍。該結論為全組分人參發酵食品工業化生產提供理論數據。