不同年份高良姜揮發油成分分析及其指紋圖譜

袁 源，林麗靜，黃曉兵*，彭芍丹，李積華

（中國熱帶農業科學院農產品加工研究所，廣東 湛江 524001）

高良姜，別名高涼姜、良姜、蠻姜和佛手根等，為姜科山姜屬多年生草本植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的根莖[1]。主產于廣東湛江徐聞縣，廣泛分布于我國廣東、廣西、海南、云南、臺灣等地區[2]。

揮發油是高良姜的主要活性成分之一，具有鎮痛止嘔雙重藥理作用[3]。由于其良好的抑菌性及抗氧化作用[4-5]，其應用范圍廣泛，除藥用外，還常作為香料添加至食品以及香水等日化用品中[6-8]。高良姜揮發油中的1,8-桉葉素在2005年版《中國藥典》里被作為高良姜含量檢測的指標性物質[1]。作為辛溫類藥材，揮發油是判斷其質量優劣的指標之一。已有研究表明不同產地和品種的高良姜揮發油的組成成分及其含量差異顯著[9-12]。

氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術在分析未知復雜樣品，常出現譜庫中幾個化合物與同一色譜峰進行匹配，無法得到準確結果。引入保留指數（retention index，RI）作為質譜定性分析的補充和驗證十分有效[13-14]。在同一柱上，物質的RI與柱溫呈線性關系[15]。采用RI與MS共同定性，可使準確度大大提高[16-18]。國內關于高良姜揮發油的成分分析多采用MS直接定性，較少利用RI進行驗證。

指紋圖譜波譜、色譜等現代分析是一種考察復雜成分均一性和穩定性的質量控制模式[19-22]。道地藥材較其他地區所產的同種藥材品質佳、療效好，具有較高知名度[23]。鑒于各種藥材中化學成分復雜，指紋圖譜技術作為可量化的綜合鑒定手段，在特定產地的藥材品種鑒別、品質考察和控制、品級劃分及評價中起到重要作用[24]。

為了更深入研究廣東湛江徐聞高良姜這種道地藥材，本研究利用GC-MS聯用技術結合RI驗證，對廣東湛江徐聞高良姜1～5 a生長年份的揮發油主要成分進行定性，采用峰面積歸一化法進行相對定量分析對比研究。同時建立高良姜揮發油指紋圖譜，有望為當地高良姜的質量控制及合理開發利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 批高良姜，1～5 a生長年份鮮姜各1 批，每批100 kg，從徐聞原產地收集采購，經清洗干燥粉碎得姜粉備用；市售干姜3 批，每批20 kg，從市面藥店采購，直接粉碎得姜粉備用。原植物標本經中國熱帶農業科學院農產品加工研究所廣東省級現代農業（熱帶農產品加工與檢測）產業技術研發中心鑒定為姜科植物高良姜。

正構烷烴C7～C30標準品、α-蒎烯標準品、1,8-桉葉素標準品、松油烯-4-醇標準品、α-松油醇標準品、α-法尼烯標準品，正己烷（色譜純） 德國Sigma公司；無水硫酸鈉（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

QP2010-Plus GC-MS聯用儀、AOC5000三合一自動進樣器、GC-MS Real Time Analysis色譜工作站 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 標準品制備

參考文獻[1]，分別取1,8-桉葉素標準品25、50 μL以正己烷稀釋20 倍至1.5 mL樣品瓶中制備標準品溶液，用于GC-MS聯用定性和定量分析。

通過外標2 點法進行定量分析，計算每100 g干藥材中1,8-桉葉素質量分數，公式如下：

取α-蒎烯標準品、松油烯-4-醇標準品、α-松油醇標準品、α-法尼烯標準品各50 μL，以正己烷稀釋20 倍至1.5 mL樣品瓶中制備標準品溶液，用于GC-MS聯用定性分析。

1.3.2 供試品制備

取上述姜粉各50 g，參考文獻[1]進行制備，平行提取3 次，計算其誤差值。揮發油相對含量計算公式如下：

上述所得揮發油經無水硫酸鈉干燥后取50 μL，以正己烷稀釋20 倍置1.5 mL樣品瓶中制備供試品溶液，用于GC-MS聯用儀檢測分析。

1.3.3 GC-MS條件

Rtx?-5ms毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：60 ℃保持6 min，以10 ℃/min升至160 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min升至240 ℃，保持10 min；進樣溫度250 ℃；載氣（He）流速1 mL/min；壓力57.4 kPa；分流比30∶1；進樣量1 μL。

電子電離源；離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑延遲2.5 min；數據采集方式全掃描；質量掃描范圍m/z 40～450；檢測器增益電壓1.18 kV。

檢索數據庫為NIST Chemical Structures庫（美國國家標準研究所數據庫，2014版），Wiley Library庫（威廉圖譜庫，第九版）。

1.4 數據處理

1.4.1 RI的計算

取C7～C30正構烷烴標準品，以正己烷為溶劑配制體積分數為0.1%的溶液，采取1.3.1節和1.3.2節相同的分析條件進行分離，測定各物質的保留時間。各成分的RI按下式計算：

式中：tx為被分析組分流出峰的保留時間/min；tn為碳原子數為n的正構烷烴流出峰的保留時間/min；tn+1為碳原子數為n+1的正構烷烴流出峰的保留時間/min；且tn＜tx＜tn+1。

1.4.2 標準偏差與相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）的計算[25]

對不同生長年份高良姜1,8-桉葉素含量標準偏差值進行計算，用來表示各年份的1,8-桉葉素含量間差異的大小。對不同生長年份高良姜主要成分峰檢測分析的保留時間RSD值進行計算，可驗證各組分峰分析結果的準確度、穩定性和重復性。

2 結果與分析

2.1 不同生長年份高良姜揮發油含量

表1 不同生長年份高良姜揮發油含量（n=3）Table1 Volatile oil contents of galangal with different ages (n= 3)

由表1可知，平行提取3 次后，以4 a生的高良姜揮發油含量稍高，顏色最深。

2.2 不同年份高良姜揮發油中1,8-桉葉素含量

1,8-桉葉素具有殺蟲、抗菌、疏風解熱、祛濕解毒的藥理活性，輔助藥物滲透作用較強[26-28]。經GC-MS分析鑒定、RI驗證以及標準品定量（標準曲線y=4.29×106x-378.32），測得不同年份高良姜揮發油中指標成分1,8-桉葉素含量見表2。

表2 不同生長年份高良姜中1,8-桉葉素含量（n=3）Table2 1,8-Cineole contents of galangal with different ages (n= 3)

由表2可知，1,8-桉葉素在各年份的原藥材中含量均高于《中國藥典》[1]規定的0.15%，第4年的1,8-桉葉素含量略高于其他年份。1,8-桉葉素在各年份藥材中含量的標準偏差為0.415%（＜0.5%），表示1,8-桉葉素在各年份藥材中的含量差異小。表明不同生長年份高良姜藥材中的1,8-桉葉素含量基本穩定。

2.3 不同年份高良姜揮發油主要特征性揮發化合物的比較分析

表3 不同年份高良姜揮發油中主要特征性揮發化合物的比較分析Table3 Comparative analysis of the main characteristic compounds in volatile oil samples from galangal with different ages

將各年份揮發油經1.3.3節所測得的組分峰用NIST Chemical Structures庫和Wiley Library庫進行檢索，結合文獻[10,16]中的RI，以質譜匹配度和RI匹配度最高的化學結構為最佳鑒定結果，可信度更高。同時采用峰面積歸一化法確定各組分相對含量。經鑒定后，結合以往文獻分析結果及藥理活性選擇其中25 種主要揮發性化合物[9-12,16,19]進行比較分析，所得結果按洗脫順序列于表3。不同生長年份的高良姜揮發油主要揮發性成分組成相似，僅是比例有差別。結果表明，1,8-桉葉素為高良姜揮發油中的主要成分，與文獻[9-12]報道相同。高良姜揮發油主要由萜烯類、醇類、酯類、酮類、醛類以及氧化物類化合物組成；各組分比例存在較大差異，通過總峰面積對各類組分不同年份的含量差異進行對比分析，見圖1。由圖1可知，高良姜揮發油中的6 類物質相對含量最高的是萜烯類化合物，其次是醇類化合物，第3是酮類化合物。隨著生長年份的延長，這6 類物質中萜烯類和氧化物類物質呈現相對含量前4 a持續上升，到第5年下降的趨勢；醇類物質呈現相對含量前3 a持續上升，第4、5年逐漸下降的趨勢；酮類、酯類、醛類物質相對含量呈現隨生長年份的延長而增加的趨勢；酯類相對含量較低反映高良姜揮發油不屬于酯類油。綜合結果表明4 a生的高良姜揮發油各組分總量最高，與表1中4 a生的姜油顏色最深的結果相符。

圖1 不同年份高良姜揮發油各類組分的含量差異對比Fig.1 Comparison of the contents of compound classes in volatile oils from galangal with different ages

2.4 高良姜揮發油指紋圖譜的建立

表4 高良姜揮發油主要特征峰保留時間Table4 Main characteristic peaks with relative retention time of volatile oils from galangal with different ages

通過對5 批不同生長年份高良姜揮發油樣品進行檢測，對在上述研究主要的25 個特征峰保留時間進行比較，5 批不同年份揮發油保留時間的RSD均小于0.1%，表示準確度高，反映GC-MS色譜儀具有較好的穩定性和精密度，分析結果可靠，結果見表4。

將5 批不同生長年份的揮發油樣品GC-MS數據，經處理后得高良姜GC-MS指紋圖譜，見圖2。通過GC-MS指紋圖譜的辨認，上述研究中所鑒定的25 個主要特征性成分峰在5 批樣品中均可明確檢出，構成徐聞產區高良姜揮發油指紋圖譜的穩定特征峰，并用此指紋圖譜對3 個市售揮發油樣品進行辨認，盡管樣品之間各峰的表觀豐度有差異，但整體峰形非常相似，可確認3 個市售產品為正品高良姜。

圖2 高良姜揮發油GC-MS指紋圖譜Fig.2 GC-MS fi ngerprints of volatile oils from galangal with different ages

3 結 論

揮發油有輔助藥物透皮吸收的作用，是衡量辛溫類中藥質量和療效的指標之一[29-30]。高良姜藥材中揮發油含量較高，辛香氣味長久以來是判斷其藥材質量優劣的一個重要指標[31]。

本研究通過對徐聞產區高良姜1～5 a生長年份的揮發油含量、指標成分1,8-桉葉素含量及主要成分進行對比分析，發現4 a揮發油含量略高于其他生長年份；各年份藥材中的1,8-桉葉素含量保持穩定；不同年份揮發油成分組成類似，但各組分比例存在較大差異。通過本研究發現高良姜的指標性成分l,8-桉葉素的含量，隨生長年份的延長基本保持穩定。然而藥效是各方面的，全面評價不能僅以一個組分的含量決定[10,16]。單味中藥所含主要活性成分比例變化對藥效的影響經常被中藥質量評價研究所忽視。高良姜揮發油包含萜烯類、醇類、酯類、酮類、醛類以及氧化物類6 類化合物，其中萜烯類化合物占主要地位。萜烯類和氧化物類物質相對含量呈現前4 a持續上升，第5年下降的趨勢；醇類物質相對含量呈現前3 a持續上升，后2 a逐漸下降的趨勢；酮類、酯類、醛類物質相對含量呈現隨生長年份延長而增加的趨勢；這是以1,8-桉葉素為指標成分所不能反映的。因此對藥材的質量評價不僅要考慮某個活性成分的含量，同時應增加能反映活性成分各類比例的質量評價方法。

本研究通過對不同年份的揮發油主要特征性揮發成分的比較分析，建立高良姜揮發油GC-MS聯用指紋圖譜，為高良姜的質量控制提供理論基礎。GC-MS聯用指紋圖譜能較全面、綜合、準確地反映揮發油的組分質量情況[19-22]。通過5 批徐聞地區不同年份高良姜揮發油中主要特征峰的定性分析，形成徐聞地區高良姜揮發油的指紋圖譜，應用于市售3 批揮發油樣品進行辨認，雖然各峰的表觀豐度有差異，但整體峰形非常相似，可確認其為正品高良姜。因此，通過尋找構成揮發油指紋的特征峰，有利于對揮發油整體性和模糊性評價，可為控制辛溫類藥材內在品質提供一定的依據。