堿-低壓復(fù)合法對(duì)大豆苷元轉(zhuǎn)化的影響

李笑梅，陳知秋，向世新

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076）

大豆異黃酮中能被人體吸收、利用[1]，發(fā)揮植物雌激素作用[2]，具有抗腫瘤[3]、抗氧化[4]和抗菌消炎等作用[5]的生理和藥理活性物質(zhì)是游離型苷元，深入研究大豆異黃酮不同結(jié)合型組分轉(zhuǎn)化為大豆苷元的技術(shù)，對(duì)更加充分合理利用大豆異黃酮資源，提高其使用價(jià)值具有一定的理論和實(shí)際意義。苷元轉(zhuǎn)化可分為3 步[6]：第1步是乙酰基型異黃酮在弱堿或加熱條件下可水解為丙二酰基型[7]；第2步是丙二酰基型在弱堿或高溫下水解為葡萄糖苷型，通常來(lái)說(shuō)在適宜的堿性條件下前兩步可同時(shí)進(jìn)行[8]；第3步是葡萄糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元，此步是目前研究的熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外研究成果主要集中在酸水解[9-12]、酶解[13-17]和微生物降解法[17-21]。堿-低壓復(fù)合法首先通過(guò)堿水解原料中的乙酰基型、丙二酰基型實(shí)現(xiàn)葡萄糖苷型大豆異黃酮的積累，為后續(xù)進(jìn)一步利用低壓實(shí)現(xiàn)葡萄糖苷型向苷元的轉(zhuǎn)化奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，為大豆苷元轉(zhuǎn)化制備技術(shù)的開(kāi)發(fā)提供一條新的原料預(yù)處理途徑和參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆異黃酮粉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%） 河南眾信生物科技有限公司；大豆素、大豆黃素、染料木素、大豆苷、大豆黃苷、染料木苷（純度均為99%） 西安市天園生物制藥廠；甲醇（色譜純） 美國(guó)天地公司；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制；其余均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜（配有Waters2489紫外檢測(cè)器和Empower 2色譜工作站） 美國(guó)沃特世科技有限公司；1200 LC C18色譜柱 美國(guó)安捷倫公司；80-2型離心機(jī)上海逸龍科技有限公司；XXXTD恒溫水浴振蕩器北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；PHS-25 pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠；AS3120A超聲波儀 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；GMSX-280溫度壓力表 上海宜川上嶺儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 6 種大豆異黃酮的定性定量檢測(cè)1.3.1.1 大豆異黃酮混合標(biāo)準(zhǔn)液的配制

定量稱取大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品，溶于80%甲醇溶液中，超聲30 min后定容，配制成6 種單標(biāo)液，質(zhì)量濃度為400 μg/mL。再用上述6 種標(biāo)液以相同比例分別配制48、96、144、192、240 μg/mL系列質(zhì)量濃度大豆異黃酮混和標(biāo)液[22]。

1.3.1.2 6 種大豆異黃酮定性定量檢測(cè)

采用高效液相色譜法進(jìn)行定性定量檢測(cè)，流動(dòng)相為甲醇和水，采用梯度洗脫：0～40 min：20%甲醇溶液～60%甲醇溶液；40～50 min：60%甲醇溶液。流速1.2 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為259 nm。各單標(biāo)于0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后依次進(jìn)樣，以6 種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間定性，以峰面積定量。各計(jì)算公式如式（1）～（9）：

式中：m為每種大豆異黃酮絕對(duì)質(zhì)量/mg；C為各類型大豆異黃酮回歸方程得出其質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為定容體積/mL；m1、m5、m2、mp分別為原料中、堿水解后、低壓后、低壓對(duì)應(yīng)高溫處理后苷元絕對(duì)質(zhì)量/mg；ma、mb、mc、mg、mh、mi分別為原料中大豆素、大豆黃素、染料木素、大豆苷、大豆黃苷、染料木苷的絕對(duì)質(zhì)量/mg；md、me、mf分別為低壓后大豆素、大豆黃素、染料木素的絕對(duì)質(zhì)量/mg；m3、m4分別為原料中、堿水解后葡萄糖苷絕對(duì)質(zhì)量/mg；mj、mk、ml、mm、mn、mo分別為堿水解后大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素的絕對(duì)質(zhì)量/mg；m6為高溫下苷元損失的絕對(duì)質(zhì)量/mg；p’和p”分別為葡萄糖苷增長(zhǎng)率、低壓處理后苷元轉(zhuǎn)化率/%。

1.3.2 堿水解

將5 g大豆異黃酮粉溶于30 mL蒸餾水中，20 ℃超聲30 min后加入稀堿溶液調(diào)pH值，于一定溫度振蕩一定時(shí)間，中和后定容至100 mL，3 000 r/min離心90 min，取上清液過(guò)0.45 μg微孔濾膜兩次后上高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)[23]。

1.3.3 堿水解單因素試驗(yàn)

評(píng)價(jià)指標(biāo)為葡萄糖苷增長(zhǎng)率，采用高效液相色譜法檢測(cè)，以堿水解pH 11、時(shí)間60 min、溫度60 ℃為基本條件。在其他條件不變的情況下，分別考察堿水解時(shí)間（30、40、50、60、70 min）、堿水解pH（9、10、11、12、13）和溫度（45、50、60、65、70 ℃）對(duì)葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率的影響。對(duì)照組為未經(jīng)堿化前處理的大豆異黃酮原料，各組試驗(yàn)重復(fù)3 次。1.3.4 響應(yīng)面法確定最優(yōu)堿水解條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以水解時(shí)間、pH值和溫度為影響葡萄糖苷型增長(zhǎng)率的主要考察因素，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)。因素及水平見(jiàn)表1。并采用多元回歸分析，擬合二次多項(xiàng)式回歸模型的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)[24]，進(jìn)行結(jié)果分析，得最優(yōu)堿水解工藝條件。

表1 堿水解Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table1 Coded levels of independent variables used in Box-Behnken design for alkaline hydrolysis

1.3.5 堿水解最優(yōu)條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在響應(yīng)面試驗(yàn)得到的最優(yōu)條件下重新進(jìn)行堿水解，并進(jìn)行葡萄糖苷增長(zhǎng)率的計(jì)算，與響應(yīng)面各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，驗(yàn)證最優(yōu)條件。

1.3.6 低壓轉(zhuǎn)化

將大豆異黃酮粉在堿水解最優(yōu)條件下處理后離心取上清液，配制成一定料液比，低壓作用后進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。120 ℃以上高溫會(huì)破壞苷元結(jié)構(gòu)[24]，為排除高溫對(duì)苷元的破壞作用，堿水解樣品還需在常壓下油浴，溫度、作用時(shí)間和料液比與低壓處理?xiàng)l件相對(duì)應(yīng)，采用高效液相色譜測(cè)定。

1.3.7 低壓處理的單因素試驗(yàn)

以苷元轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用高效液相色譜法檢測(cè)，考察時(shí)間、料液比、壓力3個(gè)因素，每組試驗(yàn)均設(shè)置常壓下相同條件油浴對(duì)照組。以苷元轉(zhuǎn)化率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，各組試驗(yàn)重復(fù)3 次。

單因素試驗(yàn)考慮高壓處理中不同條件下對(duì)苷元轉(zhuǎn)化率的影響時(shí)，同時(shí)因?yàn)楦邏寒a(chǎn)生的高溫會(huì)對(duì)苷元造成一定影響，使其所得的量減少，為了彌補(bǔ)這一部分損失，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)又根據(jù)溫度壓力線性表，得到不同壓力下所對(duì)應(yīng)的溫度，并且對(duì)堿水解后的樣品進(jìn)行該溫度下的油浴進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以計(jì)算高溫下苷元損失的絕對(duì)質(zhì)量。其他條件不變的情況下，設(shè)計(jì)壓力為0.1、0.15、0.20、0.25、0.30 MPa；另取堿水解后樣品分別在120、128、134、139、144 ℃，料液比1∶100（g/mL）油浴10 min，以苷元轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)探究壓力的影響；其他條件不變的情況下，分別作用6、8、10、12、14 min；另取堿水解后樣品在溫度139 ℃、料液比1∶100（g/mL）分別油浴6、8、10、12、14 min，以苷元轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)探究低壓作用時(shí)間的影響；其他條件不變的情況下，分別選擇料液比為1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140（g/mL）；另取堿水解后樣品分別在溫度139 ℃，料液比1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140（g/mL）油浴10 min，以苷元轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)探究料液比的影響。

1.3.8 響應(yīng)面法確定最優(yōu)低壓條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以壓力、時(shí)間和料液比為影響苷元轉(zhuǎn)化的主要因素，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)。低壓處理工藝響應(yīng)面試驗(yàn)的因素及水平見(jiàn)表2。并采用多元回歸分析，擬合二次多項(xiàng)式回歸模型的Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)行結(jié)果分析，得到低壓處理最優(yōu)工藝條件。

表2 低壓處理的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table2 Coded levels of independent variables used in Box-Behnken design for low-pressure processing

1.3.9 低壓最優(yōu)條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到最優(yōu)條件后進(jìn)行低壓處理，并計(jì)算苷元轉(zhuǎn)化率，與之前各組的苷元轉(zhuǎn)化率比較，驗(yàn)證最優(yōu)條件。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3 次，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析，采用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)方案、建立數(shù)學(xué)模型并進(jìn)行多元回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 6 種大豆異黃酮標(biāo)樣定性及定量結(jié)果

根據(jù)原料中大豆異黃酮各組分出峰時(shí)間與混標(biāo)各組分的出峰時(shí)間大致相同，得到峰面積y對(duì)大豆異黃酮質(zhì)量濃度x（μg/mL）進(jìn)行回歸分析，回歸方程分別為：大豆素：y=129.55x-43.855，r=0.999 6；大豆黃素：y=61.151x-53.554，r=0.998；染料木素：y=105.85x-50.178，r=0.999 1；大豆苷：y=53.574x-34.498，r=0.998 7；大豆黃苷：y=60.494x-43.071，r=0.998 6；染料木苷：y=71.444x-27.151，r=0.999 0。線性范圍為0～40 μg/mL。

根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素的絕對(duì)質(zhì)量分別為10.03、6.45、0.8、1.59、0.87、0.58 mg。3 種結(jié)合型和3 種游離型異黃酮的總絕對(duì)質(zhì)量分別為17.28、3.04 mg。

2.2 大豆異黃酮堿水解的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 堿水解時(shí)間對(duì)葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率的影響

由圖1可知，隨著堿水解時(shí)間的延長(zhǎng)，物料與溶劑接觸越來(lái)越充分，物質(zhì)溶解完全，葡萄糖苷型增長(zhǎng)率升高，當(dāng)水解時(shí)間為60 min時(shí)，增長(zhǎng)率最大，隨著水解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，增長(zhǎng)率開(kāi)始降低，可能因?yàn)樗鈺r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)糖苷結(jié)構(gòu)的破壞程度也相應(yīng)增加，同時(shí)原料溶出的雜質(zhì)過(guò)多，給分離和檢測(cè)帶來(lái)阻礙，故適宜堿水解時(shí)間為50～70 min。

圖1 堿水解時(shí)間對(duì)葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on the increase rate of glucoside isof l avones

圖2 堿水解pH值對(duì)葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis pH on the increase rate of glucoside isof l avones

2.2.2 堿水解pH值對(duì)葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率的影響由圖2可知，隨著堿水解pH值的增加，丙二酰基水解，葡萄糖苷型增長(zhǎng)率升高，當(dāng)水解pH 11時(shí)，增長(zhǎng)率最大，隨著pH值繼續(xù)增加，分子母核因不耐強(qiáng)堿環(huán)境而發(fā)生斷裂失去活性[25]，因而增長(zhǎng)率開(kāi)始降低，故適宜水解pH值在10～12之間。

2.2.3 堿水解溫度對(duì)葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率的影響

圖3 堿水解溫度對(duì)葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the increase rate of glucoside isof l avones

由圖3可知，隨著堿水解溫度的升高，葡萄糖苷增長(zhǎng)率升高，可能因?yàn)橐欢囟扔欣诒；偷乃鈁26]，溫度的升高也促進(jìn)了糖苷的溶解，從而得率不斷增大，當(dāng)水解溫度為65 ℃時(shí)，增長(zhǎng)率最大，隨著溫度繼續(xù)增加，增長(zhǎng)率開(kāi)始降低，可能是過(guò)高的溫度破壞了糖苷結(jié)構(gòu)，但仍高于50、55 ℃時(shí)的增長(zhǎng)率，故適宜水解溫度在60～70 ℃之間。

2.3 堿水解條件優(yōu)化的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)利用Design-Expert軟件，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表3所示。

表3 堿水解的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table3 Box-Behnken design with response variable for alkaline hydrolysis

利用Design-Expert得到響應(yīng)值與被檢變量之間的關(guān)系。對(duì)表3試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到了葡萄糖苷大豆異黃酮增長(zhǎng)率的回歸方程：Y=210.85+3.06A-24.96B-2.10C-9.18AB+24.23AC-14.52BC-19.98A2-79.41B2-1.52C2。

為檢驗(yàn)擬合方程的有效性，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分析，其中葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率回歸方程及顯著性結(jié)果見(jiàn)表4，對(duì)該模型的方差分析見(jiàn)表5。

從表5可知，試驗(yàn)所選用的模型顯著（P＜0.05），校正決定系數(shù)值為0.783 1，說(shuō)明此模型能解釋78.31%響應(yīng)值變化，相關(guān)系數(shù)R值為0.926 5說(shuō)明擬合程度好，適合度缺損（失擬項(xiàng)）P值為0.797 6，P值大于0.5，不顯著，說(shuō)明殘差均由隨機(jī)誤差引起，進(jìn)一步說(shuō)明此模型的擬合度良好。離散系數(shù)表示試驗(yàn)的精確度，數(shù)值越大，表明試驗(yàn)的可靠性越差[27]，本試驗(yàn)中變異系數(shù)為10.28%，模型方程能較好地反應(yīng)真實(shí)值[27]。綜上所述，回歸模型擬合程度好，試驗(yàn)誤差較小，模型合適。

模型一次項(xiàng)A不顯著（P＞0.05），二次項(xiàng)A2不顯著（P＞0.05）；一次項(xiàng)B顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)B2極顯著（P＜0.01）；一次項(xiàng)C、二次項(xiàng)C2不顯著（P＞0.05）；交互項(xiàng)AB、BC顯著（P＜0.05），交互項(xiàng)AC不顯著（P＞0.05）。

表4 葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率擬合多元二次方程模型的方差分析Table4 Analysis of variance (ANOVA) for the effect of alkaline hydrolysis conditions on the increase rate of glucoside isof l avones

表5 多元回歸模型方差分析Table5 ANOVA for the quadratic polynomial model

F值反映了各因素對(duì)葡萄糖苷增長(zhǎng)率的影響程度，F(xiàn)值越大表明對(duì)增長(zhǎng)率的影響越大[28]，由表4可知，各因素對(duì)葡萄糖苷增長(zhǎng)率影響程度的大小順序?yàn)椋核鈖H值＞水解時(shí)間＞水解溫度。

2.4 堿水解各因素交互作用分析

圖4 堿水解條件對(duì)葡萄糖苷型增長(zhǎng)率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots showing the interactive effects of hydrolysis conditions on the increase rate of glucoside isof l avones

由圖4a可知，等高線密集呈橢圓形，時(shí)間與pH值交互顯著，對(duì)指標(biāo)影響大。pH值曲面坡度陡峭，水解時(shí)間曲面平緩，pH值對(duì)指標(biāo)影響更為顯著。當(dāng)pH 11左右時(shí)，增長(zhǎng)率最大，隨后增長(zhǎng)率隨著pH值的增加而降低；由圖4b可知，等高線稀疏呈圓形，溫度與時(shí)間交互作用弱，對(duì)結(jié)果影響不顯著。當(dāng)溫度到65 ℃左右，時(shí)間在50 min左右增長(zhǎng)率最大；由圖4c可知，溫度與pH值交互顯著，pH值對(duì)葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率影響顯著，溫度影響不大。

2.5 堿水解參數(shù)優(yōu)化及驗(yàn)證結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert軟件得到堿水解的最優(yōu)條件為：時(shí)間48.92 min、溫度63.36 ℃、pH 11.5，此條件下葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率為299.32%，考慮到實(shí)際操作的可行性，參數(shù)調(diào)整為時(shí)間49 min、溫度63 ℃、pH 11.5，將參數(shù)代入擬合方程，計(jì)算得出在此條件下葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率為298.73%。在最優(yōu)校正條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，增長(zhǎng)率分別為287.36%、284.55%、287.29%，重復(fù)性好，平均值為286.40%，得出的實(shí)驗(yàn)值與理論值差異不顯著，可確定該多元二次回歸方程適合于對(duì)葡萄糖苷增長(zhǎng)率的預(yù)測(cè)，且結(jié)果準(zhǔn)確。

由表3可知，水解時(shí)間50 min、pH 12、溫度65 ℃時(shí)，葡萄糖苷型大豆異黃酮增長(zhǎng)率達(dá)280.37%，小于最優(yōu)校正條件下所得結(jié)果，但結(jié)果差異不顯著（P＞0.05），考慮工藝所需時(shí)間的長(zhǎng)短和溫度高低及成本，仍考慮采用最優(yōu)校正條件。

2.6 低壓處理單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 壓力對(duì)大豆苷元轉(zhuǎn)化率的影響

由圖5可知，隨著壓力的增加，壓力破壞葡萄糖苷鍵的能力逐漸增大，苷元轉(zhuǎn)化率升高，當(dāng)壓力為0.25 MPa時(shí)，轉(zhuǎn)化率最大，隨著壓力的繼續(xù)增大，低壓破壞了苷元結(jié)構(gòu)[29]，轉(zhuǎn)化率開(kāi)始降低，但仍高于之前的水平，故適宜水解壓力在0.2～0.3 MPa。

圖5 壓力對(duì)苷元轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of pressures on the conversion rate of aglycones

2.6.2 壓力作用時(shí)間對(duì)大豆苷元轉(zhuǎn)化率的影響

圖6 壓力作用時(shí)間對(duì)苷元轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of low-pressure processing time on the conversion rate of aglycones

由圖6可知，隨著壓力作用時(shí)間的延長(zhǎng)，壓力持續(xù)作用于葡萄糖苷鍵，鍵斷裂幾率增大，苷元轉(zhuǎn)化率升高，10 min時(shí)轉(zhuǎn)化率最大，隨著壓力作用時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率開(kāi)始降低，可能是持續(xù)的壓力作用破壞了苷元結(jié)構(gòu)，故適宜低壓作用時(shí)間在8～12 min之間。

2.6.3 料液比對(duì)大豆苷元轉(zhuǎn)化率的影響

圖7 料液比對(duì)苷元轉(zhuǎn)化率的影響Fig.7 Effect of solid-to-solvent ratio on the conversion rate of aglycones

由圖7可知，隨著溶液提取試劑的增加，壓力與溶液的接觸增加，更加均勻地作用于溶質(zhì)，苷元轉(zhuǎn)化率升高，當(dāng)料液比為1∶120（g/mL）時(shí)，轉(zhuǎn)化率最大，隨著提取試劑比例的繼續(xù)增加，轉(zhuǎn)化率略有降低，但仍高于之前水平，故適宜料液比在1∶100～1∶140（g/mL）之間。

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化低壓條件的結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)利用Design-Expert軟件，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果如表6所示。

表6 低壓處理的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table6 Box-Behnken design with response variable for low-pressure processing

利用Design-Expert得到響應(yīng)值與被檢變量之間的關(guān)系。對(duì)這些試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到了大豆苷元轉(zhuǎn)化率回歸方程：Y=16.65+0.55A+0.42B-0.087C-0.033AB-0.010AC-0.065BC-1.23A2-1.40B2-0.43C2。為檢驗(yàn)方程有效性，進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分析，其中苷元轉(zhuǎn)化率回歸方程及顯著性結(jié)果見(jiàn)表7，對(duì)該模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表8。

表7 大豆苷元轉(zhuǎn)化率擬合多元二次方程模型的方差分析Table7 ANOVA for the effect of low-pressure processing conditions on the conversion rate of aglycones

表8 多元回歸模型方差分析Table8 ANOVA for the quadratic polynomial models

由表7可知，試驗(yàn)選用的模型極顯著（P＜0.01），校正決定系數(shù)值為0.974 2，說(shuō)明此模型能解釋97.42%響應(yīng)值變化；相關(guān)系數(shù)R值為0.994 3，說(shuō)明擬合程度好；變異系數(shù)1.21%，變異系數(shù)小，試驗(yàn)的可靠性高。綜上所述，歸模型擬合程度好，試驗(yàn)誤差小，模型合適。模型一次項(xiàng)A和B，二次項(xiàng)A2和B2對(duì)響應(yīng)值影響極顯著（P＜0.0 1），二次項(xiàng)C2對(duì)響應(yīng)值的影響顯著（P＜0.05）；一次項(xiàng)C，交互項(xiàng)AB、BC、AC對(duì)響應(yīng)值的影響均不顯著（P＞0.05）。由表7可知，各因素對(duì)苷元轉(zhuǎn)化率影響程度的大小順序?yàn)椋簤毫Γ緯r(shí)間＞料液比。

2.8 低壓處理各因素交互作用分析

圖8 低壓條件對(duì)苷元轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plots showing the interactive effects of lowpressure processing conditions on the conversion rate of aglycones

由圖8a可知，時(shí)間與壓力交互不顯著。在10 min、0.25 MPa左右時(shí)轉(zhuǎn)化率最大；由圖8b可知，壓力與料液比交互顯著，壓力曲線坡度陡峭，時(shí)間曲線平緩，壓力對(duì)轉(zhuǎn)化率影響更為顯著。隨著壓力的增加，轉(zhuǎn)化率升高，0.25 MPa左右轉(zhuǎn)化率最大；由圖8c可知，時(shí)間與料液比交互顯著，其中料液比對(duì)轉(zhuǎn)化率影響小，時(shí)間影響效果顯著。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，苷元轉(zhuǎn)化率逐漸升高，10 min左右時(shí)轉(zhuǎn)化率最大。

2.9 低壓處理參數(shù)優(yōu)化及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert軟件，求出被檢變量的最優(yōu)值：壓力0.26 MPa、時(shí)間10.3 min、料液比1∶117.68（g/mL），此條件下大豆苷元轉(zhuǎn)化率為16.75%。考慮操作的可行性，參數(shù)調(diào)整為：壓力0.26 MPa、時(shí)間10.3 min、料液比1∶120（g/mL），將參數(shù)代入擬合方程得苷元轉(zhuǎn)化率為16.74%。在最優(yōu)校正條件下進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為16.58%、16.71%、16.71%，重復(fù)性好，平均值為16.67%，與理論值差異不顯著，該多元二次回歸方程適合于對(duì)大豆苷元轉(zhuǎn)化率預(yù)測(cè)，且結(jié)果準(zhǔn)確。

由表6得知，壓力0.25 MPa、料液比1∶120（g/mL）、時(shí)間10 min時(shí)苷元轉(zhuǎn)化率可達(dá)16.65%，小于最優(yōu)校正條件下所得結(jié)果，但結(jié)果差異不顯著（P＞0.05），考慮后者工藝所需壓力和時(shí)間均低于最優(yōu)條件下的壓力和時(shí)間，在降低生產(chǎn)成本的基礎(chǔ)上仍能獲得與最優(yōu)校正條件下相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果，故將壓力0.25 MPa、時(shí)間10 min、料液比1∶120（g/mL）作為最優(yōu)工藝條件。

3 結(jié) 論

原料中葡萄糖苷型大豆異黃酮絕對(duì)質(zhì)量為17.28 mg，苷元3.04 mg。在堿水解最優(yōu)條件為pH 11.5、溫度63 ℃、時(shí)間49 min，葡萄糖苷型大豆異黃酮的絕對(duì)質(zhì)量為49.49 mg，增長(zhǎng)率為286.40%。獲得了葡萄糖苷型大豆異黃酮的積累。后接低壓最優(yōu)條件為壓力0.25 MPa、時(shí)間10 min、料液比1∶120（g/mL），在此條件下苷元絕對(duì)質(zhì)量達(dá)11.29 mg，苷元轉(zhuǎn)化率為16.65%。由此得出堿水解對(duì)原料中乙酰基型、丙二酰基型轉(zhuǎn)化葡萄糖苷型大豆異黃酮效果顯著。單一的低壓處理對(duì)苷元轉(zhuǎn)化率雖有效果，但遠(yuǎn)低于酶法[8-12]，而且低壓伴隨的120 ℃以上高溫就會(huì)對(duì)苷元有破壞作用[30]。由此后續(xù)研究側(cè)重以堿水解為前處理的炒制、適宜低壓、固定化酶、微生物發(fā)酵等復(fù)合技術(shù)，進(jìn)一步提高大豆苷元轉(zhuǎn)化率。