痰熱清注射液對AECOPD患者外周血單核細胞TLRs/NF-κB信號通路及下游細胞因子的影響*

劉 銳 葉傳冬 雷寧寧 何 嘉 侯體保 劉秀芳

（1.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫藥大學，廣西 南寧530001）

在慢性阻塞性肺疾病（COPD）發病過程中，出現超出日常狀況，需要改變COPD日常基礎用藥的情況稱慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）[1]。 AECOPD在中醫學中屬“咳嗽”“喘證”“肺脹”等范疇，臨床多以清熱化痰、行氣活血、宣降肺氣為治則[2]。不少研究發現[3-7]，痰熱清注射液清熱、解毒、化痰的作用機制可能與降低血清細胞炎癥因子白細胞介素-8（IL-8）、白細胞介素-17（IL-17）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等水平有關。本次臨床研究在已有研究明確痰熱清注射液治療AECOPD有效的基礎上，擬對該藥抗炎相關作用機制進行探索，為該藥物的臨床運用提供更可靠的實驗依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 1）診斷標準：痰熱郁肺證候辨證標準參照《中醫內科學》[8]，癥見咳逆喘息氣粗，痰黃或白，黏稠難咯，胸滿煩躁，或發熱汗出，口渴欲飲，舌質暗紅，苔黃或黃膩，脈滑數。西醫診斷標準參照2016版GOLD[9]以及 2013 年《慢性阻塞性肺疾病診治指南》[10]。40歲以上患者若符合下列指標，應考慮為COPD。（1）慢性咳嗽，可為間歇性咳嗽，伴或不伴有咯痰表現，發作性喘息；（2）慢性咳痰，任何形式的慢性咳痰可能提示COPD；（3）呼吸困難，隨時間進行性加重，特征性表現為活動后加重，持續存在；（4）反復下呼吸道感染；（5）危險因素，宿主因素（如遺傳因素、先天發育異常等）、吸煙（包括當地流行的煙草制品）、家庭烹調和取暖燃料產生的煙霧、職業粉塵、蒸汽、煙霧、氣體，以及其他化學物質；（6）COPD家族史和/或幼年因素，例如出生低體質量、幼年反復呼吸道感染等；（7）支氣管擴張劑后FEV1/FVC＜70%，可確定存在持續氣流受限。如果有相應的癥狀和明顯的危險因素接觸，則可診斷慢阻肺；（8）AECOPD[2]，短期內出現呼吸和全身狀況惡化，患者通常會有全身炎癥反應，肺動脈高壓，甚至呼吸衰竭。2）納入標準：確診為AECOPD同時符合中醫辨證為痰熱郁肺型患者，年齡40～80歲，經醫院倫理委員會同意且患者簽署知情同意書，并愿意接受醫生治療、完成全程治療者。3）排除標準：對本藥過敏者。具有嚴重心力衰竭（心功能Ⅳ級），合并肝、腎、造血系統等嚴重原發疾病、精神病患者，合并肺結核、真菌、腫瘤等肺原發病，肺性腦病患者。合并肺栓塞、氣胸、胸腔積液者。

1.2 臨床資料 選取2016年12月至2017年12月廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院呼吸內科、老年病科AECOPD住院患者60例，按照隨機、對照原則，采用區組隨機化方法分為對照組與治療組各30例。對照組男性20例，女性10例；年齡51～79歲，平均 （73.20±5.19）歲；中醫證候評分（9.40±1.10）分；病程 5～30 年，平均（10.40±4.64）年。治療組男性22例，女性8例；年齡 49～80 歲，平均（72.60±5.67）歲；中醫證候評分（9.20±1.35）分；病程 7～28 年，平均（12.01±7.40）年。兩組資料比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

1.3 治療方法 對照組入院后給予常規改善通氣、解痙平喘、止咳化痰并根據病原學及藥敏試驗予抗感染等治療。治療組在常規治療上另給予中成藥痰熱清注射液（上海凱寶藥業有限公司生產，國藥準字Z20030054）20 mL，用250 mL 5%葡萄糖注射液或者0.9%氯化鈉注射液稀釋后靜脈滴注，每日1次，10 d為1個療程。

1.4 觀察指標 1）細胞因子：兩組患者分別于入院第1、11日清晨抽取靜脈血5 mL，離心分離血清，-80℃保存，用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測 TNF-α、IL-8、IL-17（武漢華聯科生物技術有限公司試劑盒），核因子NF-κB（美國 Active Motif公司試劑盒），具體操作見試劑說明書。2）分離外周血單核細胞及檢測單核細胞膜表面TLR4蛋白表達：兩組患者分別于入院第1、11日清晨抽取靜脈血2 mL，用肝素鈉抗凝，用紅細胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司）分離外周血單個核細胞兩次，4℃ 1500 r/min離心10 min，棄上清液，加入pH 7.45 PBS，1500 r/min 離心 10 min， 取 100 μL 加 入CD14-FITC抗體和TLR4-PE抗體（美國BD公司），避光4℃下孵育30 min，后4℃ 1500 r/min離心4 min，棄上清液，加PBS 400 μL，重懸過濾至流式試管中，放在FACSCalibur型流式細胞儀上測定106/100 μL外周血單核細胞中TLR4 PE-H陽性百分率。

1.5 中醫療效標準 根據《中藥新藥臨床研究指導原則》[11]，病情積分標準按等級記分。 發熱：0、1、2、3 級，計 0、2、3、4 分。痰的色、質、量：0、1、2、3 級，計 0、2、3、4分。 咳嗽：0、1、2、3 級，計 0、2、3、4 分。 氣喘：0、1、2 級，計 0、1、2 分。口干：0、1、2、3 級，計 0、1、2、3 分。肺部啰音：0、1、2、3 級，計 0、1、2、3 分。 療效分為臨床控制、顯效、有效、無效4級。臨床控制：主要癥狀、體征完全或基本緩解，客觀指標恢復正常，治療后總積分減少≥90%，即（治療前積分-治療后積分）/治療前積分×100%≥90%。顯效：主要癥狀、體征明顯緩解，客觀指標接近正常，治療后總積分減少≥70%。有效：主要癥狀、體征好轉，客觀指標有所改善，治療后總積分減少≥30%。無效：主要癥狀、體征無變化，客觀指標變化不明顯或加重，治療后總積分減少＜30%。

1.6 統計學處理 應用SPSS21.0統計軟件。符合正態分布的計量資料數據以（±s）表示。計數資料百分率（%）表示，應用χ2檢驗。正態分布樣本組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多次比較采用重復測量方差分析。非正態分布組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組臨床療效比較 見表1。治療組總有效率高于對照組（P＜0.05）。

表1 兩組臨床療效比較（n）

2.2 兩組治療前后血清 IL-8、IL-17、TNF-α、NF-κB水平比較 見表2。兩組治療前TNF-α、IL-8、IL-17比較，差異均不大（均P＞0.05）。兩組治療后TNF-α、IL-8、IL-17較本組治療前降低（均P＜0.05），且治療組下降幅度均大于對照組（均P＜0.05）。

表2 兩組治療前后血清TNF-α、IL-8、IL-17、NF-κB水平比較（分，±s）

表2 兩組治療前后血清TNF-α、IL-8、IL-17、NF-κB水平比較（分，±s）

與本組入院第1天比較，*P＜0.05；與對照組治療第11天比較，△P＜0.05。下同

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2.3 兩組外周血單核細胞中TLR4陽性百分率比較見表3，圖1、圖2。兩組治療前TLR4陽性百分率比較，差別不大（P＞0.05）。兩組治療后TLR4陽性百分率較本組治療前下降（P＜0.05），且治療組下降幅度大于對照組（P＜0.05）。

表3 兩組外周血單核細胞TLR4陽性百分率比較（%，±s）

表3 兩組外周血單核細胞TLR4陽性百分率比較（%，±s）

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圖1 兩組入院第1天TLR4陽性百分率情況

圖2 兩組入院第11天TLR4陽性百分率情況

3 討 論

COPD根據其咳嗽、咯痰、氣喘等癥狀歸屬于中醫學“肺脹”范疇，中醫學對于COPD病因病機的研究頗多。認為其發生多由久病肺虛、感受外邪及年老體虛所導致。肺脹的基本病機總屬本虛標實，肺、腎、心、脾臟器虧虛為本，痰濁、水飲、血瘀互結為標，二者彼此影響，互為因果，復為外邪所誘發，而致氣道壅塞，肺氣脹滿，不能斂降，發為肺脹[12]。《醫學三字經》言“然肺為氣之主，諸氣上逆則嗆而咳，是咳嗽不止于肺，而亦不離乎肺也”[13]。關于COPD的發病機理也各有論述，如水飲客肺，《內經素問·逆調論》云“不得臥，臥則喘者，是水氣之客也”[14]；外邪客肺，巢元方提出“肺主于氣……為息奔上氣”[15]。肺脹與中氣，《柳選四家醫案》記載“咳而吐沫……中氣傷矣”[16]。可以看出，肺脹的發生，多因久病肺虛，痰濁潴留而致肺不斂降，氣還肺間，肺氣脹滿，每因復感外邪誘使病情發作或加劇。

痰熱清注射液由多味中草藥采用先進的配制技術制成，組方具體包括黃芩、連翹、熊膽粉、金銀花、山羊角。配伍中黃芩為君藥，具有抗炎、抗變態反應作用，Fan等研究發現，黃芩提取物可能參與抑制脂多糖誘導的細胞下游炎癥因子的合成與釋放[17]。熊膽粉、山羊角為臣藥，具有緩解痙攣、消除炎癥、抗驚厥等作用，鄭億等研究發現，熊膽粉對小鼠體內體外大腸埃希菌等多種細菌具有明顯的抑制作用[18]。現代藥理研究發現山羊角提取物對傷寒等病毒所致發熱的兔具有明顯解熱作用；金銀花與連翹配伍能夠抑制和殺滅多種病原微生物，《本草綱目》記載金銀花具有“久服輕身、延年益壽”之功，為“瘡家圣藥”。

TLR4是人類發現的第一個TLR相關蛋白，幾乎分布于所有的細胞系，主要表達在參與宿主防御功能的細胞，以骨髓單核細胞的表達最多[19]，其主要介導革蘭氏陰性菌表面的脂多糖（LPS）的信號轉導，并通過其信號途徑激活 NF-κB， 啟動 TNF-α、IL-8、IL-17的轉錄翻譯，激發炎癥因子的瀑布效應[20]。如今關于TLRs參與天然免疫的的研究已達到一個新的水平，對TLRs傳導通路的深入研究可以更科學的了解機體天然免疫中的分子機制。但目前對于COPD發病機制中關于TLRs的研究多停留在動物模型水平，本研究旨在研究TLRs表達在COPD患者氣道炎癥過程的具體作用。

本研究以TLR4/NF-κB信號通路為靶點，觀察到使用痰熱清注射液治療后TNF-α、IL-8、IL-17均明顯降低，抑制炎癥因子表達。進一步觀察到治療后TLR4、NF-κB表達下調，表明痰熱清注射液能夠直接抑制單核細胞TLR4蛋白表達，進而抑制NF-κB活化，調控炎癥因子 TNF-α、IL-8、IL-17 轉錄。

綜上所述，在常規治療基礎上加用痰熱清注射液可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活減輕AECOPD患者炎癥反應，本研究體現了中西醫聯合治療AECOPD的優勢，為痰熱清注射液治療AECOPD提供了理論和試驗依據，值得臨床推廣使用。