地黃活性成分梓醇在大鼠體內的代謝變化研究*

陳少云 周 靜 李 敏 范紅晶 張宇燕

（浙江中醫藥大學，浙江 杭州 310053）

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的塊根，始載于《神農本草經》，列為上品。鮮地黃具有清熱生津、涼血、止血的功效，生地黃具有清熱涼血、養陰生津的功效，其炮制品稱為熟地黃，具有補血滋明、益精填髓的功效[1]。現代藥理學及臨床研究表明，地黃具有較好的增強免疫功能、止血、抗腫瘤、抗衰老、保護中樞神經系統、降血糖、保護胃簽黏膜、降血脂、保肝等作用[2-10]。

地黃主要含有環烯醚萜苷類等物質，其中含量最高的環烯醚萜苷是梓醇[11]。而目前對地黃物質基礎的研究也比較集中的是環烯醚萜類成分，主要以梓醇比較突出[12-13]。大量研究表明，梓醇在心腦血管系統、中樞神經系統、降血糖、調血脂、抗腫瘤、抗輻射、抗骨質疏松、抗炎、提高免疫等均有較強的藥理活性[14-18]。梓醇的提取工藝研究也使其具備了大量生產的可能性[19-20]，同時也開展了梓醇在大鼠體內的相關藥代動力學研究[21-22]，但關于梓醇的體內代謝途徑和代謝產物尚不清楚，其發揮藥效功能的作用機制也有待進一步深入。本實驗采用HPLC-MS聯用技術檢測大鼠口服地黃水提液后體內梓醇的代謝變化，初步探討梓醇在體內的可能代謝途徑和變化規律，可為地黃及含有梓醇的藥物的體內外代謝分析和進一步的藥效結合研究提供參考。

1 材 料

1.1 實驗動物 SPF清潔級SD雄性大鼠，體質量（200±20）g，購于浙江中醫藥大學動物實驗中心（上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供），動物實驗條件許可證：SCXK（浙）2013-0184。

1.2 試藥與儀器 地黃采購于浙江中醫藥大學名中醫館，經鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libosch.的塊根，批號：20170307；其余試劑和藥品均為進口或國產分析純。Agilent GC6890（安捷倫科技）；質譜Qtrap 4500 （AB SCIEX）；HWS26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器）；HH-2數顯恒溫水浴鍋 （常州國華電器）；DHG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱 （上海精宏實驗設備）；3-18K高速冷凍離心機（美國Sigma-Aldrich）。

2 方法與結果

2.1 地黃水提液的制備 稱取地黃50 g，充分粉碎，用10倍體積蒸餾水于45℃恒溫水浴中浸提8 h后過濾，濾液濃縮至1 g/mL，作為地黃水提液。

2.2 血漿樣品的制備 取8只SD大鼠，其中空白對照組2只，其余為實驗組。禁食，自由飲水，12 h后對實驗組的大鼠分別灌胃地黃水提液（15 mL/kg），于給藥后 5、15、30、45、60、90、120、240、360、480 min 眼 眶取血0.3 mL，置于離心管中，在8000 r/min條件下離心10 min，取上層血漿置于離心管中，-20℃冷藏備用。1 h內各取樣點尾靜脈注射0.3 mL生理鹽水，1 h后各取血點腹腔注射0.3 mL生理鹽水以補充血容量。

2.3 HPLC-MS分析血漿中梓醇及潛在代謝物 取血漿0.2 mL加入20% 三氯乙酸水溶液20 μL沉淀蛋白，渦旋2 min，在 12000 r/min條件下離心 10 min，取上清液，0.45 μm水系微孔濾膜過濾，HPLC-MS進樣分析。HPLC條件：色譜柱Zorbax C18柱，梯度洗脫，流動相A：水（含2 mmol/L乙酸銨和0.05%甲酸），流動相B：乙腈（含 0.05%甲酸），柱溫 40℃，流速 0.7 mL/min。MS 條件：負離子模式，CUR 25，IS 5500，TEM 575，GS1 60，GS2 60，CAD Medium。對質譜圖進行分析，并根據梓醇及代謝可能途徑的碎片離子分析判斷梓醇及潛在代謝物，結果見表1、圖1、圖2，結果表明，梓醇進入大鼠體內后，除其本身分子以外，發現了6個轉化后的產物，分別是：異構體（Isomer）、甲基化物（M1， Methylation）、羥基化物（M2，Hydrogenation）、糖基化物（M3，Glucose）、 脫氧羥基化物 （M4，Hydrogenation+Loss of O）、脫氧羥基化甲基化物 （M5，Methylation+Hydrogenation+Loss of 2O），并推斷其可能的結構。測定各個時間點的梓醇及潛在代謝物的濃度觀察在大鼠體內的代謝變化過程，見圖3，結果顯示，梓醇及其多個代謝物在大鼠血液中的濃度均在灌胃后45 min達到最高，隨后呈下降趨勢，在240 h時基本代謝完成。

表1 梓醇潛在代謝物列表

圖1 梓醇及其代謝物的質譜圖

圖2 梓醇及其可能代謝途徑

圖3 梓醇及其代謝物的代謝變化曲線

3 分析與討論

梓醇是地黃的主要活性成分，具有較強的藥理活性，也是地黃物質基礎研究的重點，本實驗采用HPLC-MS聯用技術，根據梓醇的結構及碎片離子規律，分析鑒定出地黃水提液進入大鼠體內后，大鼠血漿中除了梓醇分子以外，還有1個異構體和5個轉化產物：異構體、甲基化物、羥基化物、糖基化物、脫氧羥基化物和脫氧羥基化甲基化物，并推斷其可能的結構，分析梓醇體內代謝途徑。

從動態代謝過程曲線顯示，梓醇及其代謝物在大鼠血液中的濃度均在灌胃后45 min達到最高，隨后呈下降趨勢，240 h后濃度降至最低。梓醇與其代謝物可同時存在于大鼠體內，協同發揮較強的藥理活性，本研究可以為地黃及含有梓醇的藥物的體內外代謝分析、與藥效結合的藥動學-藥效學（PK-PD）研究及對深入梓醇的作用機理研究提供參考。