高毒力肺炎克雷伯菌誘導人外周血中性粒細胞凋亡延遲及其影響核因子-κB的潛在機制

杜芳玲， 王蓮慧， 魏丹丹， 萬臘根， 張 偉， 劉 洋

自從20世紀80年代中期，在我國臺灣地區社區獲得性肝膿腫患者中發現，高毒力肺炎克雷伯菌（hvKP）新型變種已經成為了一種世界性的感染疾病病原體[1-3]。與經典的肺炎克雷伯菌（nonhvKP）感染不同的是，hvKP菌株不僅可以引起免疫力低下患者的醫院感染，還可以引起免疫力正常患者社區獲得性的嚴重感染。hvKP菌株的另外一個典型特征是它具備從原始感染部位向身體其他組織器官侵襲的能力，導致遠端組織器官的感染，即遷徙性感染的發生[4]，這在革蘭陰性桿菌引起的感染中很少見，其具體致病機制至今不 明。

目前已發現，中性粒細胞在hvKP菌株的遷徙性播散中發揮重要作用。以往研究表明誘導中性粒細胞凋亡不僅與細菌的毒力有關，還可能涉及病原體免疫逃逸及宿主體內生存[5]，故了解hvKP誘導中性粒細胞凋亡異常對闡明其致病性有重要意義。核因子-κB（NF-κB）作為一個重要的核因子，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。本研究旨在分析hvKP菌株誘導人外周血中性粒細胞凋亡及對NF-κB的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

hvKP菌株Kp1500分離自臨床肝膿腫患者。患者表現出遷徙性播散感染，并參照相關文獻[6]對其高黏表型（拉絲試驗陽性）和高毒力基因型（K1莢膜血清分型及攜帶 pLVPK毒力質粒 ）進行了相關確認[7]。肺炎克雷伯菌ATCC 700603（屬K6血清莢膜分型）為non-hvKP菌株，作為對照菌株。

1.2 細胞株來源和培養

人中性粒細胞分離自我院健康體檢志愿者，采用含10%胎牛血清（FCS）的RPMI1640（GIBCO）培養液在37 ℃，5% CO2條件下培養細胞。

1.3 檢測方法

1.3.1 細胞凋亡檢測 ①感染患者體內中性粒細胞凋亡檢測：抽取hvKP和non-hvKP感染患者外周血3～5 mL，提取外周血中性粒細胞37 ℃條件下分別孵育0、3、6、9 h后檢測細胞凋亡情況；②體外誘導中性粒細胞凋亡檢測：提取健康體檢志愿者外周血中性粒細胞。將hvKP菌株（組）和nonhvKP菌株（組）的新鮮培養物在15 ℃、12 000 r/min離心15 min，沉淀的菌體用無抗生素的2% FCS RPMI1640培養液重懸。按細菌∶細胞=10︰l的比例，將細菌懸液加于單層細胞培養物中，37 ℃條件下分別孵育0、3、6、9 h。凋亡檢測為：棄培養液，用pH7.4、0.01 mol/L滅菌PBS洗滌3次后收集細胞，按AnnexinV kit（caltag Laboratories，USA）操作說明書，采用流式細胞儀（Coulter，Epics xL，USA）檢測細胞凋亡情況。實驗中同時設置不加細菌的正常細胞對照組（0.9 % NaCl 溶液）。早期凋亡細胞可被FITC-Annexin V著色，但不被PI著色，晚期凋亡和壞死細胞可被2種染料同時著色，活細胞不被染料著色，各實驗組重復試驗3次。

1.3.2 中性粒細胞呼吸爆發的測定 中性粒細胞懸液中加二氫若丹明（dihydrorhodamine，DHR），37 ℃孵育2 min，加菌株刺激10 min，流式細胞儀檢測單通道5 000個細胞，激發波長488 nm，發射波長510～550 nm，結果以平均通道熒光強度表示。分別檢測對照組、hvKP組及nonhvKP組的第30、95、165 min 上述指標，各實驗組重復試驗3次。

1.3.3 Westem blot法檢測NF-кB p65 按1.3.1中②方法收集hvKP菌和non-hvKP菌并分別感染健康志愿者中性粒細胞 3、6、9 h。用pH7.4、0.01 mol/L滅菌PBS洗滌3次后收集細胞，調整細胞懸液濃度約為106/mL。按蛋白提取試劑盒說明書提取細胞蛋白，蛋白質變性后行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），電泳條件為200 V。電泳完畢后進行轉膜，制作濾紙（Whatman，3 MM CHR）-凝膠-膜“三明治”，極恒流300 mA轉移70 min，于加樣槽中加入相應的一抗（Abcam公司）約1 mL（1∶300），室溫下于搖床孵育。用含吐溫20的磷酸緩沖鹽水（PBST）洗滌10 min，每個加樣槽中加入二抗1 mL左右，室溫下于搖床孵育1 h。用電化學發光（ECL）進行底物化學發光，ECL試劑用前配制，暗室曝光5～30 s，照相。WB系統可靠性采用內參β-actin進行校正，內參蛋白陽性提示提取的蛋白完整有效。WB檢測結果以Gelpro3.2凝膠光密度分析軟件處理數據，以平均光密度值（D）/內參β-actin之比計算NF-кB p65蛋白相對表達含量。

1.4 統計學方法

采用SPSS15.0統計學軟件，組間均數比較采用t檢驗，P＜0.0l表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 hvKP與non-hvKP感染患者外周血中性粒細胞的凋亡率

hvKP感染患者外周血中性粒細胞，隨著時間延長，凋亡率逐漸升高，在不同時間（0、3、6、9 h）凋亡率均顯著低于non-hvKP組和對照組（P＜0.01）。而non-hvKP感染外周血中性粒細胞不同時間（0、3、6、9 h）凋亡率與對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

2.2 hvKP和non-hvKP體外誘導外周血中性粒細胞凋亡率

hvKP體外誘導人外周血中性粒細胞后，隨著時間延長，凋亡率逐漸升高。hvKP誘導人外周血中性粒細胞不同時間（0、3、6、9 h）凋亡率均顯著低于non-hvKP組和對照組（P＜0.01）。而non-hvKP組與對照組之間則差異無統計學意義（P＞ 0.05），見圖2。

圖1 hvKP和non-hvKP感染患者外周血中性粒細胞凋亡圖Figure 1 Apoptosis of neutrophils in patients infected with hypervirulent K. pneumoniae （hvKP） and non-hvKP strains in vitro

圖2 hvKP和non-hvKP體外誘導中性粒細胞凋亡圖Figure 2 Apoptosis of neutrophils induced by hypervirulent K. pneumoniae （hvKP） and non-hvKP strains in vitro

2.3 外周血中性粒細胞NF-κBp65蛋白含量的變化

與對照組相比，hvKP組和non-hvKP組隨著時間延長NF-κB p65蛋白表達逐漸增多，且各個時間點（3、6、9 h）均高于對照組； 而non-hvKP組與對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 Western blot檢測hvKP和non-hvKP感染外周血中性粒細胞不同時間點時p65蛋白表達變化Figure 3 Western blots for p65 protein expression levels in human neutrophils following hvKP or non-hvKP stimulation

2.4 呼吸爆發功能差異

hvKP體外感染患者外周血中性粒細胞后，各時間點（0、30、95、165 min）中性粒細胞的呼吸爆發強度顯著低于non-hvKP組和對照組（P＜0.01）。而non-hvKP組與對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

3 討論

hvKP的臨床致病特點及細菌表型特征與傳統的醫院感染肺炎克雷伯菌存在較大差異[8]，前者感染嚴重，以多發性膿腫為主要特征，可引起多部位感染（如眼內炎、腦膜炎、肝膿腫等），往往集中于健康青年患者，多為社區獲得性感染，但近年也出現醫院獲得性感染[9-11]。此外，hvKP多表現出高黏性，常攜帶magA、rmpA及產氣菌素等多種毒力基因，往往具備獨特的表型和基因型特征[12]。中性粒細胞為機體內最活躍的炎性細胞，在臟器內大量聚集、活化是導致相關炎癥性疾病惡化的中心環節。已有研究表明中性粒細胞或在hvKP菌感染中發揮重要作用[5]。激活的中性粒細胞可產生大量自由基、蛋白水解酶及炎性介質等有害物質造成組織損傷。適度清除中性粒細胞是控制炎癥發展的重要措施。因此，凋亡作為中性粒細胞重要的非炎性清除方式，在炎癥的發生、發展及轉歸中具有十分重要的作用。但關于hvKP感染時，中性粒細胞的作用及轉歸，與hvKP菌感染發生發展的關系等，鮮見報道。

圖4 hvKP和non-hvKP不同時間點刺激外周血中性粒細胞呼吸爆發強度變化Figure 4 Intracellular reactive oxygen species generation in peripheral neutrophils at different times after hvKP or nonhvKP stimulation

由于中性粒細胞是終末分化細胞，不具備分化、增殖能力，所以當中性粒細胞凋亡受到抑制時，勢必導致其生命期限延長。以往研究顯示，中性粒細胞凋亡延遲可導致有毒產物釋放的機會相對增多，這將加重自身組織細胞損傷。呼吸爆發是中性粒細胞發揮殺菌的重要手段，呼吸爆發功能增強可顯著增加中性粒細胞殺菌能力[13]。然而，我們對1株hvKP研究發現，雖然hvKP菌株較non-hvKP在體內外均可顯著誘導人外周血中性粒細胞凋亡延遲。然而，我們意外發現，較nonhvKP，hvKP導致人外周血中性粒細胞呼吸爆發能力顯著降低，由此我們推測hvKP菌株雖然可以增強凋亡延遲而促進中性粒細胞對hvKP菌株的作用及吞噬，但卻可通過抑制其呼吸爆發功能以減少中性粒細胞對hvKP菌株的損傷及殺滅，如此或可促進hvKP菌株在中性粒細胞內的生存，導致hvKP菌更易通過以中性粒細胞為載體在全身進行播散，造成多臟器的遷徙性感染，這與Lin等[5]的研究報道一致。

已有研究表明，NF-κB具有抑制中性粒細胞凋亡的作用[14]。其可能通過中性粒細胞凋亡相關基因的表達調控，延遲中性粒細胞凋亡，從而間接加劇了炎癥狀態。p65是NF-κB二聚體（p65/p50）主要亞單位之一，代表了NF-κB的激活程度[15]。靜息狀態時，p65與KB抑制蛋白（IKB）結合，不具有調節基因轉錄的能力，當細胞受到細胞外信號刺激時，蛋白激酶被激活，IKB磷酸化并降解，從而釋放p65，使其得以轉位進入細胞核中，誘導靶基因的轉錄。因此我們推測hvKP誘導中性粒細胞凋亡延遲的作用可能是通過調節NF-κB活性從而抑制中性粒細胞凋亡。本研究結果顯示，hvKP感染人外周血中性粒細胞 NF-κB p65蛋白的表達逐漸增多，且NF-κB p65蛋白的表達與中性粒細胞凋亡呈現明顯負相關，說明在hvKP感染時，外周血中性粒細胞NF-κB的活化可能與中性粒細胞的凋亡延遲有關。

綜上所述，本研究發現hvKP可早期通過活化NF-κB而表現出抑制中性粒細胞凋亡，導致中性粒細胞生命周期延長，從而增強其對hvKP的吞噬及抗感染作用。但意外的是，其卻可抑制中性粒細胞呼吸爆發功能而導致中性粒細胞對hvKP殺滅能力下降，如此或可導致hvKP被中性粒細胞吞噬卻無法殺滅，最終造成其在全身播散形成遷徙性感染，具體機制有待進一步深入研究。