BaP和DDT暴露對(duì)翡翠貽貝胚胎重要酶活性影響的比較研究

林芳，毛楷林，江秀，周海龍

海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570228

環(huán)境中污染物可通過(guò)吸收代謝以及食物鏈的傳遞危害人類(lèi)健康，其中，多環(huán)芳烴污染廣泛分布于環(huán)境中。苯并芘(benzopyrene, BaP)及滴滴涕(dichlorodiphenyl trichloroethane, DDT)是多環(huán)芳烴中的典型代表，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，易在環(huán)境中蓄積。丘耀文等[1]研究發(fā)現(xiàn)，大亞灣海域中海水多環(huán)芳烴平均總含量已大于10 000 ng·L-1，表層沉積物平均總含量為(481 ± 316) ng·g-1，其中BaP在海水中含量已達(dá)633 ng·L-1。DDT曾廣泛應(yīng)用于植物保護(hù)和公共衛(wèi)生方面，主要以噴霧方式施用，土壤是DDT最主要的環(huán)境介質(zhì)。調(diào)查顯示，我國(guó)海河、長(zhǎng)江和珠江流域水體及水體沉積物中DDT的污染較重，其中海河流域水體中DDT及其代謝物的平均濃度高達(dá)580 ng·L-1[2]。由于生物體具有富集作用，植物及人體中均可檢測(cè)到DDT的存在，貴州省人體脂肪中DDT的含量達(dá)5 700 ng·g-1，北京和沈陽(yáng)地區(qū)人體母乳中的DDT的殘留量分別為180 ng·g-1和150 ng·g-1[3-4]。

雙殼貝類(lèi)對(duì)有機(jī)污染物具有較強(qiáng)的富集作用，是海洋環(huán)境污染的一種重要指示生物[5]。與脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)相比，貝類(lèi)不存在特異性免疫系統(tǒng)，其免疫系統(tǒng)僅有體液免疫以及細(xì)胞免疫。劉世良等[6]的研究表明，貝類(lèi)的體液免疫主要通過(guò)血細(xì)胞中的水解酶類(lèi)發(fā)揮作用，如酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)等。在通常情況下，貝類(lèi)的免疫功能在脅迫因子的存在下會(huì)受到嚴(yán)重的抑制。沈文英等[7]研究發(fā)現(xiàn)，銨態(tài)氮、亞硝酸鹽氮脅迫三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)后，其非特異性免疫酶(ACP、AKP、LZM)的敏感性高于血淋巴，高濃度有毒物質(zhì)可使三角帆蚌的非特異性免疫酶活性下降。

污染物在貝類(lèi)體內(nèi)經(jīng)代謝產(chǎn)生活性氧自由基，若不及時(shí)清除將導(dǎo)致生物體內(nèi)活性氧失衡，導(dǎo)致氧化損傷[8]。而抗氧化防御系統(tǒng)能夠在貝類(lèi)受到污染物脅迫后清除活性氧自由基，該系統(tǒng)廣泛存在于貝類(lèi)體內(nèi)，在這個(gè)過(guò)程中，抗氧化酶，如超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)等發(fā)揮重要作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，翡翠貽貝(Pernaviridis)在全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)的脅迫下，2種組織的GPx和GSH活性均被明顯誘導(dǎo)或抑制，丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量明顯升高，表明抗氧化防御系統(tǒng)的變化反映了PFOS對(duì)翡翠貽貝的脅迫效應(yīng)[10]。張先勇等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在BaP脅迫下馬氏珠母貝(Pinctadamartensi)的肝組織SOD酶活性表現(xiàn)出先受抑制后被誘導(dǎo)的變化規(guī)律。

翡翠貽貝是熱帶以及亞熱帶重要的環(huán)境指示物種，胚胎是海洋動(dòng)物早期發(fā)育的一個(gè)重要階段，對(duì)環(huán)境脅迫敏感。因此，研究其胚胎毒性對(duì)海洋環(huán)境保護(hù)、維持物種生物多樣性具有重要的生態(tài)學(xué)意義[12]。本論文旨在通過(guò)研究BaP和DDT對(duì)翡翠貽貝胚胎抗氧化酶以及非特異性免疫酶的脅迫效應(yīng)，評(píng)價(jià)其毒理效應(yīng)，以期篩選出敏感生物標(biāo)志物，為海洋環(huán)境污染早期預(yù)警以及海洋環(huán)境的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成年翡翠貽貝取自海南陵水黎安港無(wú)污染海域，體長(zhǎng)約為6.0～7.0 cm，通過(guò)鏡檢選取性腺發(fā)育良好的雌、雄各50只，用剪刀除去外殼上的足絲以及殼面的附著物，于水族箱中暫養(yǎng)3 d(溫度為(25±2) ℃；鹽度為32‰；pH為8.2±0.1)。之后，通過(guò)人工誘導(dǎo)受精的方式獲得胚胎，于溫度(281) ℃，鹽度30‰1‰，pH為8.1±0.1的海水中培養(yǎng)胚胎。實(shí)驗(yàn)所用海水取自海南陵水黎安港無(wú)污染海域，經(jīng)沙濾處理后備用。

1.2 主要試劑與儀器

苯并[a]芘(BaP)分析純，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；滴滴涕 (DDT) 分析純，購(gòu)自德國(guó)Dr公司；SOD測(cè)試盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)測(cè)試盒、ACP測(cè)試盒、AKP測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Multiskan FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；PerkinElmer Lambda 25紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司；Eclipse E100體視顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；5810R冷凍高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；SL-1800D超聲細(xì)胞破碎儀購(gòu)自南京順流儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

根據(jù)海區(qū)污染程度及相關(guān)參考文獻(xiàn)來(lái)設(shè)置BaP和DDT的濃度[1, 13]，用適量DMSO溶解，配成儲(chǔ)存液，實(shí)驗(yàn)時(shí)將母液稀釋。設(shè)置2個(gè)處理組(25、50 μg·L-1)進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，同時(shí)設(shè)置DMSO溶劑對(duì)照(0.005%)與海水空白對(duì)照組，每組濃度設(shè)置3個(gè)平行。通過(guò)人工受精技術(shù)獲取胚胎，并在40倍顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育進(jìn)程，待發(fā)育至D形期后，將翡翠貽貝胚胎轉(zhuǎn)移到不同BaP和DDT濃度的海水中進(jìn)行暴露試驗(yàn)。試驗(yàn)玻璃缸體積為20 L，海水水質(zhì)參數(shù)為：溫度(281) ℃，鹽度30‰1‰，pH 8.1±0.1，分別于暴露24 h、48 h后用500目濾布過(guò)濾混勻后的海水收集貝苗，置于凍存管中，并放入無(wú)菌PBS，于液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品預(yù)處理

將樣本混勻后用100目細(xì)胞篩過(guò)濾除雜，再用無(wú)菌PBS沖洗過(guò)500目細(xì)胞篩去除質(zhì)量不高的胚胎。并在顯微鏡下調(diào)整胚胎的密度為20個(gè)·μL-1。隨后將其放置于冰上并用超聲細(xì)胞破碎儀破碎成組織勻漿液。按照試劑盒的說(shuō)明立即用于測(cè)定SOD、GSH-Px、ACP、AKP酶的活性。

1.5 酶活力和蛋白含量測(cè)定

用于酶活測(cè)定的胚胎每個(gè)處理組約為1 200個(gè)，酶活性測(cè)定方法主要參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.6 數(shù)據(jù)的處理與分析

結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方法，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA),同時(shí)采用Duncan多重比較法分析各組間差異顯著性(P< 0.05為差異顯著)。綜合生物標(biāo)志物響應(yīng)(IBR)指數(shù)的計(jì)算按照Pytharopoulou等[14]的方法，先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，其次通過(guò)星狀圖呈現(xiàn)計(jì)算可用來(lái)衡量生物指標(biāo)整合影響的可視化生物標(biāo)志化結(jié)果，最后依照Oliveira等[15]介紹的方法計(jì)算RIB值。RIB值越大，表明生物所受影響越大。

2 結(jié)果(Results)

2.1 翡翠貽貝胚胎應(yīng)答B(yǎng)aP和DDT脅迫的抗氧化酶研究

翡翠貽貝胚胎應(yīng)答B(yǎng)aP和DDT脅迫的抗氧化酶活力響應(yīng)如圖1，結(jié)果表明BaP和DDT在不同濃度脅迫條件下，對(duì)翡翠貽貝胚胎的SOD和GPx活性均產(chǎn)生了顯著影響(P< 0.05)。與對(duì)照組相比，用BaP和DDT暴露24 h后，隨著濃度的升高SOD的活性受到明顯的抑制，整體活性小于對(duì)照組，差異顯著(P< 0.01)。暴露48 h后，SOD的活性表現(xiàn)為隨著濃度的升高，酶活整體升高，50 μg·L-1處理組與25 μg·L-1相比，SOD酶活性差異不顯著(P>0.01)。BaP和DDT脅迫48 h的SOD酶活比脅迫24 h的酶活大，且BaP處理后的SOD酶活比DDT大。而在BaP和DDT脅迫24 h后，GPx的酶活力隨著濃度的升高也逐漸增大，且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系(P< 0.05)。染毒48 h后，GPx的活性與SOD具有相似的規(guī)律，受到明顯的誘導(dǎo)作用，且在50 μg·L-1達(dá)到最大值。

2.2 翡翠貽貝胚胎應(yīng)答B(yǎng)aP和DDT脅迫的非特異性免疫酶研究

BaP和DDT脅迫翡翠貽貝胚胎后，其非特異性免疫酶(AKP、ACP)的活性影響見(jiàn)圖2。翡翠貽貝胚胎在BaP和DDT染毒后ACP活力表現(xiàn)出規(guī)律不一致的變化，與對(duì)照組相比，DDT脅迫初期(24 h)，處理組濃度為25 μg·L-1時(shí)ACP的酶活性變化并不顯著(P>0.05)，但50 μg·L-1時(shí)與對(duì)照組差異顯著(P< 0.05)，處理組(25 μg·L-1和50 μg·L-1)之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，整體呈下降趨勢(shì)。DDT脅迫48 h后，不同處理組之間進(jìn)行比較差異不顯著(P>0.05)。

在BaP脅迫初期(24 h)，濃度為25 μg·L-1的ACP酶活性差異顯著(P<0.05)，處理組之間(25 μg·L-1和50 μg·L-1)沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，與DDT染毒后表現(xiàn)出相似的規(guī)律，整體也呈下降趨勢(shì)。但在BaP染毒48 h后，其ACP的酶活力表現(xiàn)出先降低后升高的規(guī)律。就相同處理組而言，苯并芘和滴滴涕脅迫48 h的ACP酶活力比24 h的要高一些。此外，苯并芘和滴滴涕脅迫對(duì)翡翠貽貝胚胎的AKP活力影響規(guī)律基本一致，與對(duì)照組相比，脅迫處理對(duì)貽貝胚胎有顯著影響(P<0.05)，脅迫24 h，BaP和DDT處理組的活性均下降，但下降幅度有差別，脅迫處理組25 μg·L-1和50 μg·L-1之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。與對(duì)照組相比，暴露48 h后BaP和DDT脅迫均誘導(dǎo)AKP的酶活性，隨著暴露濃度的增加酶的活性有顯著性差異(P<0.05)，存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，在50 μg·L-1時(shí)其酶活性達(dá)到最大值。

圖1 翡翠貽貝胚胎應(yīng)答B(yǎng)aP和DDT脅迫的抗氧化酶活力響應(yīng)注：柱形圖上方字母表示Duncan多重比較法分析各組間差異顯著性結(jié)果，各組間凡標(biāo)有一個(gè)相同字母的即為差異不顯著(P>0.05)，凡無(wú)相同字母的即為差異顯著(P<0.05)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)n = 3。Fig. 1 The responses of antioxidase activities in Perna viridis embryo under the exposure of BaP and DDTNote: The letters above the bar graph indicate the results of the difference significance test between the groups using Duncan's multiple comparison method. Each group that is marked with an identical letter means the difference is not significant (P>0.05), and with different letters means the difference is significant (P < 0.05). Each experiment was repeated 3 times.

圖2 BaP和DDT對(duì)翡翠貽貝胚胎非特異性免疫酶影響注：柱形圖上方字母表示Duncan多重比較法分析各組間差異顯著性結(jié)果，各組間凡標(biāo)有一個(gè)相同字母的即為差異不顯著(P > 0.05)，凡無(wú)相同字母的即為差異顯著(P<0.05)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)n = 3。Fig. 2 The responses of immune enzyme in Perna viridis embryo under the exposure of BaP and DDTNote: The letters above the bar graph indicate the results of the difference significance test between the groups using Duncan's multiple comparison method. Each group that is marked with an identical letter means the difference is not significant (P>0.05), and with different letters means the difference is significant (P < 0.05). Each experiment was repeated 3 times.

2.3 整合生物標(biāo)志物分析

在BaP和DDT脅迫下不同染毒時(shí)間點(diǎn)的翡翠貽貝胚胎的整合生物標(biāo)志物分析結(jié)果見(jiàn)圖3及圖4。星狀圖中4個(gè)方向軸分別代表4種生物標(biāo)志物(SOD、GPx、ACP、AKP)，RIB值即為圖中根據(jù)4種酶的響應(yīng)所構(gòu)成的多邊形面積。用BaP和DDT分別處理后，在不同的時(shí)間點(diǎn)(24 h和48 h)，高濃度(50 μg·L-1)和中濃度組(25 μg·L-1)翡翠貽貝胚胎4種抗氧化酶受到誘導(dǎo)或抑制；與對(duì)照組相比，濃度在50 μg·L-1和25 μg·L-1的星狀圖覆蓋的面積較大。在相同時(shí)間點(diǎn)，BaP和DDT相比，DDT的RIB星狀區(qū)域面積較大。

進(jìn)行時(shí)間-效應(yīng)分析(圖5)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組在24 h和48 h的RIB值變化不明顯。在中濃度和高濃度組的BaP和DDT脅迫24 h后，隨著濃度升高RIB星狀區(qū)域面積逐漸增大。在BaP和DDT脅迫48 h后，RIB星狀區(qū)域面積呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但降幅不明顯。就相同處理組而言，RIB在中濃度和高濃度組48 h的值明顯小于24 h，且DDT的RIB值比BaP值大。

3 討論(Discussion)

在動(dòng)物整個(gè)生命周期中，早期胚胎對(duì)毒性物質(zhì)最敏感，課題組的前期研究表明翡翠貽貝胚胎暴露于苯并芘36 h后，出現(xiàn)了殼緣內(nèi)凹、絞合線(xiàn)內(nèi)凹、不完全的殼、鋸齒狀的殼緣、凸出覆蓋物等一系列畸形特征，并且隨著暴露濃度的增加、暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，胚胎畸形率及死亡率也相應(yīng)增大[13]。本研究試圖從翡翠貽貝胚胎的抗氧化酶和非特異免疫系統(tǒng)角度探討B(tài)aP和DDT的毒性作用，并尋找敏感的生物標(biāo)志物。

圖3 BaP脅迫下翡翠貽貝胚胎RIB星狀圖(左：24 h；右：48 h)Fig. 3 IBR of Perna viridis embryo under BaP exposure (left: 24 h; right: 48 h)

圖4 DDT脅迫下翡翠貽貝胚胎RIB星狀圖(左：24 h；右：48 h)Fig. 4 IBR of Perna viridis embryo under DDT exposure (left: 24 h; right: 48 h)

圖5 BaP和DDT脅迫下翡翠貽貝胚胎整合生物標(biāo)志物響應(yīng)指標(biāo)(RIB)時(shí)間效應(yīng)的變化Fig. 5 Temporal variation of R IB in Perna viridis embryo under the stress of BaP and DDT

貝類(lèi)的免疫防御主要依靠體液免疫和細(xì)胞免疫，血清中的非特異性抗菌肽、溶菌酶等體液因子在免疫防御中發(fā)揮重要作用；其中溶菌酶活性、抗菌酶活性等都是衡量貝類(lèi)免疫防御機(jī)能的重要指標(biāo)[21]。而ACP和AKP廣泛分布于動(dòng)物組織中，是溶酶體中重要的體液因子，其中ACP在酸性環(huán)境中通過(guò)破壞表面帶有磷酸酯的外源異物，可預(yù)防感染[22]。AKP在調(diào)節(jié)跨膜運(yùn)輸以及生物體DNA、RNA、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)代謝起著重要作用[23]。有研究表明，無(wú)論是遭受機(jī)械損傷還是生存環(huán)境的惡化，都會(huì)使甲殼類(lèi)動(dòng)物的ACP、AKP活性發(fā)生變化，因此這2種酶活性的變化可以作為貝類(lèi)養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測(cè)及病理變化的檢測(cè)指標(biāo)[24-25]。而海洋甲殼類(lèi)動(dòng)物胚胎受到有機(jī)污染物脅迫時(shí)，ACP和AKP活性會(huì)發(fā)生怎樣的變化，這方面國(guó)內(nèi)研究較少。在本實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，BaP和DDT脅迫24 h后，實(shí)驗(yàn)組胚胎的AKP活力均受到較大抑制，而在暴露48 h后，實(shí)驗(yàn)組AKP的酶活性恢復(fù)到了比對(duì)照組更高的水平，并且高濃度組活性比中濃度組更高。這似乎表明，BaP和DDT在24 h內(nèi)嚴(yán)重影響了胚胎的免疫能力，而48 h后存活下來(lái)的胚胎，為了消除BaP和DDT對(duì)自己的影響，AKP活性極大升高以對(duì)抗有毒物質(zhì)對(duì)胚胎的不利影響。有研究表明PFOS脅迫斑馬魚(yú)(Brachydaniorerio)一定時(shí)間后，斑馬魚(yú)頭部的AKP活力變化呈現(xiàn)相似的規(guī)律[26]。此外，ACP活力對(duì)BaP和DDT的響應(yīng)與AKP略有不同。在脅迫24 h后，實(shí)驗(yàn)組的ACP活力下降，其中BaP脅迫導(dǎo)致的ACP活力下降比DDT幅度更大；而48 h后，實(shí)驗(yàn)組ACP活力又恢復(fù)到接近對(duì)照組的水平。這表明，BaP和DDT在24 h內(nèi)會(huì)對(duì)翡翠貽貝胚胎的ACP活性造成一定影響，但在48 h后其活性基本恢復(fù)正常。因此，相對(duì)于ACP活性，翡翠貽貝胚胎的AKP活性對(duì)于BaP和DDT的脅迫更為敏感。

由于各種酶在不同脅迫條件下表現(xiàn)出抑制或誘導(dǎo)效應(yīng)，且響應(yīng)不同步，不同酶的敏感程度有所差異，若僅僅考慮單一的酶活性，不能很好地定量評(píng)價(jià)其毒理效應(yīng)，而整合生物標(biāo)志物響應(yīng)(Integrated Biomarker Responses，IBR)指數(shù)法可將不同生物指標(biāo)的聯(lián)合生物效應(yīng)進(jìn)行量化[14]，通過(guò)將幾種酶或與其他生物標(biāo)志物結(jié)合分析，能較準(zhǔn)確客觀地評(píng)估污染狀況以及有效預(yù)測(cè)化學(xué)物質(zhì)毒理效應(yīng)差異[27]。目前，IBR指數(shù)法已廣泛應(yīng)用于海洋污染物的分布規(guī)律調(diào)查[28]及水生生物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫應(yīng)激響應(yīng)[29-30]。程鳳蓮等[31]利用IBR分析方法對(duì)春季北部灣潮間帶多個(gè)站位污染情況進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)評(píng)估的污染程度與污染源種類(lèi)及含量測(cè)定結(jié)果具有一致性，表明IBR指數(shù)法可應(yīng)用于環(huán)境質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)。近期，王嘉慧等[32]采用IBR指數(shù)評(píng)價(jià)方法對(duì)蘆葦(Phragmitesaustralis)中過(guò)氧化物酶(POD)、超氧化歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等4種生物標(biāo)志物進(jìn)行整合分析發(fā)現(xiàn)：該評(píng)價(jià)方法可直接用于水體生態(tài)環(huán)境污染程度的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。蔣玫等[33]利用IBR指數(shù)評(píng)價(jià)法考察了柴油污染環(huán)境中黑鯛(Sparusmacrocephlus)的肝臟、肌肉等組織中SOD、CAT和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)活性隨時(shí)間的變化規(guī)律，依據(jù)對(duì)應(yīng)的IBR值對(duì)肝胰腺、鰓和肌肉3個(gè)組織的氧化應(yīng)激能力進(jìn)行了評(píng)估。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用IBR指數(shù)評(píng)價(jià)方法對(duì)翡翠貽貝胚胎中SOD、GPx、AKP、ACP這4種所選生物標(biāo)志物進(jìn)行整合分析，如圖3及圖4所示，星狀圖在濃度25 μg·L-1和50 μg·L-1時(shí)覆蓋面積明顯大于對(duì)照組面積，表明翡翠貽貝胚胎對(duì)BaP以及DDT脅迫產(chǎn)生了明顯的應(yīng)激響應(yīng)。此外，無(wú)論是BaP還是DDT，實(shí)驗(yàn)組24 h的星狀圖面積都大于48 h的面積，這可能是由于脅迫24 h后各種酶活性對(duì)BaP和DDT脅迫開(kāi)始響應(yīng)，在48 h后，大部分酶活性已經(jīng)逐漸恢復(fù)，RIB值出現(xiàn)一定幅度的降低。從RIB值隨時(shí)間的變化(圖5)分析，在相同實(shí)驗(yàn)濃度以及相同脅迫時(shí)間條件下，DDT的RIB值明顯大于BaP，表明DDT對(duì)翡翠貽貝胚胎的毒性大于BaP，這一結(jié)論與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[34-35]。同時(shí)，該研究結(jié)果可為海洋環(huán)境污染控制以及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供重要參考依據(jù)。