ADAM-17抑制劑TNF484對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

張東升，周方正，陳 潔，郭思言，聶 龍，李艷梅

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一種常見(jiàn)惡性腫瘤，其惡性程度高，臨床診斷往往都已較晚，嚴(yán)重威脅著人類的健康，抑制和控制腫瘤的轉(zhuǎn)移是治療和預(yù)防癌癥的主要策略[1,2]。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是多基因、多步驟相互作用的過(guò)程。目前有研究認(rèn)為細(xì)胞外基質(zhì)降解酶系統(tǒng)：基質(zhì)金屬蛋白酶家族和去整合素-金屬蛋白酶家族(a disintegrin and metalloproteases，ADAMs)參與了腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程。

ADAM-17被稱為α腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)換酶(tumor necrosis factor-alpha converting enzyme, TACE)，ADAM-17可以剪切脫落雙調(diào)蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等多種表皮生長(zhǎng)因子受體的配體，直接間接激活表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)相關(guān)通路來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[3]。許多研究表明，ADAM-17在許多腫瘤中過(guò)表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程，提示該基因可能在腫瘤進(jìn)展中起重要作用，ADAM-17和其他ADAM蛋白酶可能是治療癌癥和其他疾病的潛在靶標(biāo)[4]。由于其許多家族成員的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且在不同的腫瘤中表達(dá)不同，對(duì)ADAM-17抑制劑的研究尚在早期階段，因此ADAM-17對(duì)腫瘤的抑制作用需要進(jìn)一步研究，這可能使ADAM-17成為新的潛在臨床治療靶點(diǎn)。本研究旨在探討ADAM-17抑制劑TNF484對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及抑制劑 將人肝癌HepG2細(xì)胞株和Bel7402細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)液(GIBCO，USA)中培養(yǎng)，10%胎牛血清(GIBCO，USA)，在37 ℃，5%CO2和75%濕度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液每3 d更換一次。

1.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 將1×104HepG2和Bel7402細(xì)胞懸浮在96孔板中的每個(gè)孔中，加入不同濃度的抑制劑，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育72 h，正常細(xì)胞為陰性對(duì)照。孵育后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將96孔板在4 ℃下以1200 g離心10 min，小心吸出上清液，然后將每孔加入50 μl二甲基亞砜，置搖床上低速震蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm吸光度下測(cè)量各孔的吸光值(OD)。測(cè)定細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性。計(jì)算公式：抑制率IR=1-試驗(yàn)組的平均OD值/對(duì)照組的平均OD值。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)ADAM-17mRNA的表達(dá) 各組細(xì)胞于6孔板培養(yǎng)72 h后，將不同濃度(0～1 μM)的TNF484(ADAM-17抑制劑，Sigma公司)加入各組細(xì)胞培養(yǎng)。按Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參基因。RT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃, 5 min預(yù)變性后，94 ℃，20 s，退火溫度60 ℃, 20 s，共40個(gè)循環(huán)，延伸溫度72 ℃ 40 s。終止反應(yīng)。

1.4 遷移分析 使用xCELLigence系統(tǒng)(羅氏公司)檢測(cè)HCC細(xì)胞的遷移能力。在CIM-16孔反應(yīng)板的下室加入200 μl(2×104)細(xì)胞懸液，陽(yáng)性組加入TNF484，不加TNF484作為陰性對(duì)照組。然后將10%含血清的DMEM培養(yǎng)液加入下室。xCELLigence系統(tǒng)對(duì)生長(zhǎng)于反應(yīng)孔板上的細(xì)胞阻抗進(jìn)行記錄。 經(jīng)過(guò)72 h在RTCA分析儀上進(jìn)行細(xì)胞遷移分析。

1.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 使用三維共培養(yǎng)模型(Trevigen公司)測(cè)定肝癌細(xì)胞在TNF484抑制下的侵襲能力。成球和侵襲基質(zhì)成分的準(zhǔn)備按照說(shuō)明書(shū)的要求做。用DMEM和成球基質(zhì)混合細(xì)胞，在3D球培養(yǎng)板的每個(gè)孔中加入5×102個(gè)細(xì)胞，在4 ℃條件下，200 g離心3 min。將培養(yǎng)板放入37 ℃孵育72 h，讓球體形成。在加入侵襲基質(zhì)之前，在4 ℃條件下，300 g離心5 min。然后將培養(yǎng)板放入37 ℃，孵育1 h，促進(jìn)侵襲膠的形成。在孔中加入10 μM的TNF484, 每24 h記錄成球的圖像。用GraphPad Prism軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 TNF484抑制劑對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響 隨著抑制劑濃度增加，抑制率也增高，TNF484在100 μM 時(shí)對(duì)HepG2和BEL7402細(xì)胞增殖抑制作用最大(表1)。

細(xì)胞株(μmol/L)HepG2BEL-740205.8±0.94.2±0.5118.1±1.917.9±1.81060.2±2.865.3±2.55075.2±3.173.1±3.310080.0±5.685.0±5.8

注：不同濃度之間抑制率比較，P<0.05

2.2 TNF484抑制劑對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響 TNF484孵育細(xì)胞72 h，10 μM濃度條件下，即可顯著抑制細(xì)胞的遷移，HepG2細(xì)胞的空白對(duì)照組及抑制組的細(xì)胞分?jǐn)?shù)分別為80.92%±6.10%、55.60%±4.21%，BEL7402細(xì)胞的空白對(duì)照組及抑制組的細(xì)胞分?jǐn)?shù)分別為82.62%±6.15%、59.8%±4.27%，兩組之間細(xì)胞分?jǐn)?shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 TNF484抑制劑對(duì)肝癌細(xì)胞系中ADAM-17表達(dá)水平的影響 10 μM TNF484在處理72 h后HepG2及BEL-7402細(xì)胞株中ADAM17 RNA表達(dá)水平降低，抑制率分別為(45.0±3.1)%及(48.0±3.3)%，與處理前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 TNF484抑制劑對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響 與空白組相比，10 μM的TNF484顯著降低了HepG2及BEL-7402細(xì)胞的侵襲能力(圖1)，陽(yáng)性對(duì)照組第1天細(xì)胞的遷移能力分別為空白對(duì)照組的(35.7±3.1)%、(39.7±3.5)%，第15天細(xì)胞的遷移能力分別為空白組的(30.7±2.1)%、(31.2±2.6)%(P<0.05)。

圖1 TNF484抑制劑對(duì)肝癌細(xì)胞株侵襲能力的影響A.HepG2; B. BEL-7402

3 討 論

腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移是多基因、多步驟相互作用的過(guò)程，主要包括惡性腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶遷移黏附到細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)、降解并穿過(guò)ECM和基膜、通過(guò)血管進(jìn)入宿主微環(huán)境等步驟。肝癌廣泛轉(zhuǎn)移是其造成高病死率的主要原因，因此找到一種能夠抑制肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的藥物，是有效治療肝癌的關(guān)鍵。

目前的研究認(rèn)為，ADAM-17在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲中起重要作用[5]。ADAM-l7是ADAMs 家族成員之一，屬于含鋅蛋白酶，具有水解細(xì)胞膜上的腫瘤壞死因子的功能[6]。與大多數(shù)的ADAMs成員類似，ADAM-17具有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域[7]，在N端，存在保守的氨基酸序列，稱之為半胱氨酸開(kāi)關(guān)，與催化區(qū)的Zn2+結(jié)合，使ADAM-17處于酶原狀態(tài)。ADAM-17可以剪切脫落雙調(diào)蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等多種表皮生長(zhǎng)因子受體的配體，直接或間接激活EGFR相關(guān)通道。通過(guò)激活PI3K/AKT、Ras/Raf/MAPK等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)、細(xì)胞的增殖分化和侵襲[8,9]。近年來(lái)多項(xiàng)研究表明，ADAM-17 在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、結(jié)直腸癌和胰腺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程[10-12]，ADAM-17可能成為肝癌特異性治療的潛在靶點(diǎn)。

目前EGFR、VEGF等靶向治療藥物已取得滿意的臨床療效，ADAM-17 抑制藥的研究還在起步階段，需進(jìn)一步明確其抑制腫瘤作用[3,13]。TNF484是以琥珀酸為基礎(chǔ)的氧肟酸，有很強(qiáng)的TACE抑制性[4]。當(dāng)前TNF484在肝癌細(xì)胞株中的研究較少，本研究發(fā)現(xiàn)TNF484對(duì)肝癌細(xì)胞株增殖能力有明顯的抑制作用且呈劑量依賴性，且在遷移和侵襲也有著顯著的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中，TNF484在10 μM濃度條件下，HepG2和BEL7402細(xì)胞株的空白對(duì)照組及陽(yáng)性組即有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)TNF484可以顯著降低癌細(xì)胞中ADAM-17的表達(dá)，與文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致。因此，推論TNF484可能通過(guò)降低ADAM-17在HCC中的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移，進(jìn)而抑制HCC的發(fā)展。TNF484對(duì)肝癌動(dòng)物模型中腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲的抑制作用，需要進(jìn)一步檢測(cè)。

總之，ADAM-17抑制劑TNF484抑制HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。