GDF 11改善老齡鼠內皮依賴性血管舒張功能的實驗研究

劉 婷，張承英，蘇靜克，韓 寧，朱 彪

動脈硬化是一類以血管管壁增厚變硬、彈性減弱和管腔縮小為特征的疾病，它嚴重威脅著人類的健康。該病變從血管內膜起始，內皮細胞是抵御病變發生的第一道防線，而內皮依賴性血管舒張功能紊亂則是本病發生的一個早期標志[1, 2]。臨床發現，年齡是該病發生、發展的一個獨立危險因素，近90%的動脈硬化和冠狀動脈硬化性心臟病發生在55歲以上的老年人[3]。 GDF 11是一種能抵抗衰老的細胞因子，屬于轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成員[4]。最近有研究表明，通過腹腔注射重組GDF 11，能夠促進老齡小鼠腦血管內皮細胞增殖，進而增加腦血管容積、增大血流量，從而使腦血管“返老還童”[5]。動脈硬化亦屬于衰老相關性疾病，本研究探討GDF 11對老齡小鼠內皮依賴性血管舒張功能的影響，以期為臨床上治療動脈硬化提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 選擇18個月齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠20只，購自軍事醫學科學院實驗動物中心。重組人GDF 11(Pepro Tech，美國)；去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)、乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)、硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)[Sigma，美國]；脂聯素(adiponectin)ELISA試劑盒(R&D，美國)；Krebs液自行配制(2.0 L三蒸水中加入氯化鈉13.5 g，氯化鉀685.4 mg，磷酸鎂278.4 mg，磷酸二氫鈉278.4 mg，碳酸氫鈉3.7 g，氯化鈣555.0 mg和葡萄糖4.0 g)；一抗[兔抗人單克隆Smad2/3，磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)抗體]、二抗[山羊抗兔單克隆抗體(辣根過氧化物酶標記)](CST，美國)；BCA測定試劑盒(南京建成，中國)；PVDF膜(Millipore，美國)。

BL-420S型生物信號采集系統、JH-2型張力換能器與HV-4恒溫灌流系統(成都泰盟，中國)；7600-020型全自動生化分析儀(日本日立公司)；340型酶標儀(BDSL，英國)；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40型轉膜儀(北京六一，中國)。

1.2 實驗分組 小鼠于軍事醫學科學院實驗動物中心SPF級環境中飼養，環境溫度(25±1)℃，相對濕度(65±5)%，光照12 h/d。所有小鼠均單籠飼養，自由進食、進水。小鼠適應性喂養1周后按隨機數字表均分為Vehi組(n=10)和GDF11組(n=10)。GDF11組按0.3 mg/(kg·d)的劑量連續4周腹腔注射GDF11，Vehi組則注射等量生理鹽水。

1.3 小鼠體重和血液學指標檢測 每3 d測量一次所有小鼠的體重。實驗結束前12 h開始，所有小鼠禁食但不禁水。實驗結束時，按60 mg/kg的劑量腹腔注射10 g/L戊巴比妥進行麻醉，開腹后用棉簽將腹腔臟器撥至左側，BD針于后腔靜脈采血后注入黃蓋促凝采血管，待血液凝固后收集血清置于液氮中凍存備用。迅速開胸，去除肺組織，在體式顯微鏡下用顯微剪和顯微鑷剝離胸主動脈血管鞘及其周圍的結締組織。然后齊根端剪斷肋間動脈，剪下胸主動脈并將其均分為兩段，一段凍存于液氮中；另一段浸泡于Krebs液中備用(4 h內檢測)。使用全自動生化分析儀檢測血清中三酰甘油(triglycerides，TG)和膽固醇(total cholesterol，TC)的含量。嚴格按照試劑盒的使用說明，ELISA法檢測脂聯素的含量。

1.4 胸主動脈血管舒張功能測定 將每只小鼠的胸主動脈降段剪成2段，每段長約4 mm。將血管環置于含Krebs液的恒溫(37 ℃)灌流系統的浴槽中，并持續輸入95% O2+5% CO2的混合氣體。使用兩根不銹鋼鋼絲平行于管壁穿過血管環，下端鋼絲通過掛鉤固定于槽底，上端鋼絲通過掛鉤連接于張力換能器，張力換能器與生物信號采集系統相連，可記錄血管環張力的變化。調整基礎張力值為0.5 g，平衡約1 h，期間每20 min換一次Krebs液。待張力平衡后，向浴槽內加入10-6mol/L的NE收縮血管環，待血管環收縮達平臺期時記錄最大張力值。排凈含有NE的Krebs液，依次加入不同濃度(10-9～10-4mol/L；每次換液前均以Krebs液灌洗3次血管環)的Ach或者SNP誘導血管環舒張，并記錄每只小鼠各濃度下血管環的張力值(取4個血管環的平均張力)。采用下面的公式計算血管舒張率：血管舒張率(%)=[(最大張力值-各濃度點張力值)/(最大張力值-基礎張力值)]×100%。

1.5 Western blot檢測 取出液氮中凍存的主動脈，制備組織勻漿并提取總蛋白。測定總蛋白濃度后，各樣本取50 μg總蛋白，上樣于PAGE膠后電泳。電泳后轉膜于PVDF膜上，室溫下封閉2 h，分別滴加特異性一抗封閉過夜，再以辣根過氧化物酶標記的二抗封閉2 h，最后用化學發光劑染色、顯影。

2 結 果

2.1 GDF 11對老齡鼠體重及脂代謝的影響 相較于Vehi組，GDF 11干預全程不引起老齡鼠體重的改變，差異無統計學意義(圖1)，GDF 11干預顯著降低血清中TG的水平[(76.6±11.2)vs(64.5±10.4) mg/dl]，TC的濃度也呈降低的趨勢[(149±17)vs(124±20) mg/dl]。同時，GDF 11干預可顯著升高血清中脂聯素的濃度[(11.9±1.1)vs(14.2±1.7) μg/ml]。

2.2 GDF 11對老齡鼠血管舒張功能的影響 加入不同濃度Ach后，兩組老齡鼠的血管環均出現不同程度的內皮依賴性舒張，在10-6、10-5、10-4(mol/L)濃度時，GDF 11顯著升高內皮依賴性血管舒張率[(37.1±5.2)%vs(59.7±4.3)%、(48.2±4.0)%vs(78.4±5.6)%、(61.1±4.7)%vs(90.2±7.4)% ]；差異有統計學意義(P<0.05，圖2A)，而各濃度SNP誘導的非內皮依賴性血管舒張反應，兩組間差異均無統計學意義(圖2B)。

圖1 GDF 11對老齡鼠體重的影響

圖2 GDF 11對老齡鼠血管舒張功能的影響

A.不同濃度Ach誘導的內皮依賴性血管舒張反應，B.不同濃度SNP誘導的非內皮依賴性血管舒張反應。 *表示與Vehi組相比P<0.05

2.3 Samd2/3的磷酸化水平 與Vehi組相比，GDF 11組p-Smad2/Smad2 [(1.00±0.05)vs(1.78±0.10)]、p-Smad3/Smad3 [(1.00±0.09)vs(1.57±0.12)]水平顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 GDF 11對Samd2/3磷酸化水平的影響

3 討 論

本研究以重組GDF 11干預的老齡鼠為動物模型進行實驗，結果發現GDF 11可以增強老齡鼠胸主動脈內皮依賴性血管舒張功能，但對非內皮依賴性血管舒張功能無影響，從而證明GDF 11對因增齡而受損的血管內皮細胞具有保護作用。

血管內皮細胞功能紊亂是動脈硬化發生、發展的早期病理改變，檢測內皮依賴性血管舒張功能可以預測該病發生的風險，早期診斷并評估預后[6]。通過加入Ach可以誘導內皮依賴性血管舒張功能，Ach與血管內皮細胞上的M型膽堿能受體結合，刺激細胞合成、分泌內皮依賴性血管舒張因子，這些舒張因子以旁分泌的形式作用于血管壁中膜平滑肌細胞使其松弛。而硝酸甘油和SNP等硝基化合物則可以不依賴于內皮細胞，直接釋放NO等舒血管物質作用于血管平滑肌細胞使其舒張。在本研究中，兩組血管環的非內皮依賴性血管舒張功能無顯著性差異，說明血管平滑肌細胞的功能未因增齡而受損。所以Ach誘導產生的血管舒張反應差異是由于內皮細胞功能不同造成的，即GDF 11通過改善內皮依賴性血管舒張功能保護因增齡而受損的血管。以往有研究報道發現GDF 11可以改善高脂飲食誘導造成的內皮依賴性血管舒張功能紊亂[7]，這與本研究的結果相似。

動脈硬化病變從血管內膜開始出現脂質堆積，引起血管壁的炎性反應和氧化應激，巨噬細胞和T淋巴細胞浸潤，泡沫細胞形成，細胞外基質降解和平滑肌細胞增生。由此可見脂代謝異常是動脈硬化發生的病變基礎。本研究結果也表明，GDF 11能降低血清中TG和TC的濃度，并且能夠顯著升高血中脂聯素的濃度。脂聯素是脂肪細胞分泌的一種內源性的生物活性肽，已被證實具有抗動脈粥樣硬化和炎性反應的作用。以往的研究結果顯示，血管周圍脂肪組織分泌的脂聯素以旁分泌的形式[8]，機體其他部位脂肪組織分泌的脂聯素以內分泌的形式作用于血管內皮細胞，對其有直接、確切的保護作用[9, 10]。脂聯素與內皮細胞上的脂聯素受體結合后通過激活AMPK-eNOS信號途徑增加NO的產量，而血循環中脂聯素的濃度在肥胖、2型糖尿病和老年個體中均下降[11]。GDF 11可能是通過延緩因增齡而降低的脂聯素濃度或者直接升高血循環中脂聯素的含量來間接保護內皮細胞的。以上結果提示，改善脂代謝可能是GDF 11間接發揮內皮保護作用的機制之一。

TGF-β超家族廣泛參與細胞的增殖、分化和胚胎發育[12]。GDF 11可結合于細胞表面的TGF-β Ⅱ型受體，將該受體被激活后，其激酶活性將TGF-β Ⅰ型受體磷酸化激活；TGF-β Ⅰ型受體又使Smad2和Smad3磷酸化；磷酸化的Smad2和Smad3可與Smad4形成三聚體，并轉移至核內調控基因表達[13]。梅穩等[14]研究發現，GDF 11可以通過激活糖尿病小鼠內皮細胞中的Samd2/3信號通路，上調eNOS活性，進而增加NO等舒血管因子的產量來保護血管。本研究的結果也表明，GDF 11干預可以顯著提高主動脈Samd2/3的磷酸化水平。這提示激活Samd2/3信號通路可能是GDF 11直接發揮內皮細胞保護作用的信號機制之一。

綜上所述，本研究發現GDF 11能夠改善老齡鼠胸主動脈的內皮依賴性血管舒張功能。因此，升高體內因增齡而下降的GDF11濃度可能是預防和治療衰老性動脈硬化的一個潛在靶點。