常用血液制品病毒滅活的研究進(jìn)展

王曉麗 徐濤 劉亞絨

【摘 要】科學(xué)、有效的病毒滅活工藝是確保血液制品安全的重要措施，能夠有效降低因輸注血液制品而產(chǎn)生的患病風(fēng)險(xiǎn)。基于此，文章以血液制品病毒滅活為研究對(duì)象，首先分析了當(dāng)前常用的集中血液制品病毒滅活技術(shù)，然后討論了血液制品病毒滅活技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)，希望對(duì)我國(guó)血液制品安全水平的提升有所幫助。

【關(guān)鍵詞】血液制品；病毒滅活；技術(shù)

血液制品一般是指以健康人或經(jīng)特異免疫的人的血漿為原材料，經(jīng)過(guò)提純、分離，最后制備成血漿蛋白、人血白蛋白、人凝血因子、人免疫球蛋白或其他血液細(xì)胞有形成分的統(tǒng)稱(chēng)。血液制品通常用于治療及被動(dòng)免疫預(yù)防。需要注意的是，由于血液制品的原材料主要來(lái)源于人，理論上通過(guò)血液傳播的病毒也可通過(guò)血液制品進(jìn)行傳播，因此，需要對(duì)血液制品進(jìn)行全面的病毒滅活和去除工作，提高血液制品的安全性。

一、常用血液制品病毒滅活工藝研究現(xiàn)狀

（一）S/D處理法

S/D處理法是利用有機(jī)溶劑/表面活性劑分解脂包膜病毒的類(lèi)脂膜，使其失去黏附、感染和復(fù)制能力的滅活技術(shù)，并且大多數(shù)血液制品在經(jīng)過(guò)S/D處理后還能保持蛋白質(zhì)的生物活性。常用有機(jī)溶劑為磷酸三丁酯（TNBP），表面活性劑有膽酸鈉、吐溫80、TritonX-45、TritonX-100等。S/D法中所使用的有機(jī)溶劑和表面活性劑需要在滅活之后去除，以免對(duì)相關(guān)蛋白的回收率和純度造成影響。根據(jù)歐洲藥典，S/D處理的最后產(chǎn)物所允許的殘留量分別是TNBP小于2和TritonX-100少于5，事實(shí)上，在發(fā)達(dá)國(guó)家，大多數(shù)S/D血漿中的添加劑檢測(cè)閾值分別低于0.5和1，其毒性水平比歐洲藥典的低得多。需要注意的是，該方法只適用于對(duì)脂包膜病毒的滅活處理，對(duì)于無(wú)外殼病毒則需要輔助使用其他滅活方法，而且滅活劑的去除過(guò)程不僅復(fù)雜而且較為昂貴。

（二）低pH孵化法

低pH值孵化法是指在pH=4，溫度為30～37℃的環(huán)境下，持續(xù)保溫20h，使病毒中的某些成分發(fā)生變質(zhì)作用，從而降低病毒復(fù)制能力的技術(shù)。通常情況下，pH值越低，其滅活能力越強(qiáng)。在具體應(yīng)用時(shí)，一般通過(guò)加入鹽酸來(lái)制造酸性環(huán)境。免疫球蛋白在低pH值條件下蛋白質(zhì)功能活性較穩(wěn)定。國(guó)外學(xué)者在研究人細(xì)小病毒4（PARV4）的失活中，用1mol/L鹽酸將血液制品調(diào)整到目標(biāo)pH值，通過(guò)比較pH=3.5時(shí)，不同孵化時(shí)間（10min～6h）內(nèi)人細(xì)小病毒4（PARV4）、細(xì)小病毒B19（B19V）和鼠微小病毒（MVM）的滅活滴度情況。結(jié)果顯示B19V在pH=3.5酸化情況下，幾乎立即喪失感染性，且病毒滴度下降；PARV4病毒滴度下降；MVM病毒滴度幾乎不改變。這3種病毒對(duì)低pH值處理的抵抗力為MVM>PARV4>B19V。由此可見(jiàn)，該方法有著良好的脂包膜病毒滅活效果，而對(duì)于非脂包膜病毒的滅活作用卻十分有限；此外，該技術(shù)的滅活周期較長(zhǎng)，需要孵化21天。

（三）巴氏消毒法

巴氏消毒法是指在60℃的環(huán)境下，對(duì)血液制品進(jìn)行連續(xù)加熱處理（≥10h），從而破壞病毒蛋白質(zhì)和核算結(jié)構(gòu)，使其失去復(fù)制能力的滅活技術(shù)。同時(shí)，該技術(shù)能夠有效削弱病毒的傳染能力。但是，該方法常用于對(duì)血漿、免疫球蛋白、凝血因子、抗凝血?jiǎng)┮约暗鞍酌敢种苿┑犬a(chǎn)品的病毒滅活工作。該方法已公認(rèn)能大大降低病毒的危險(xiǎn)性，至今尚未見(jiàn)有病毒傳播的報(bào)道。需要注意的是，巴氏消毒法雖然是常用的病毒滅活方法，但是其所采用的高溫條件會(huì)使血漿蛋白等具有熱不穩(wěn)定的產(chǎn)品過(guò)度變性，存在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而喪失蛋白聚合及功能活性的風(fēng)險(xiǎn)，因此需要加入穩(wěn)定劑以減小病毒滅活的速率。

（四）干熱法

干熱法是指對(duì)凍干的血液制品進(jìn)行熱處理，當(dāng)前主要用于對(duì)凝血因子的處理。該技術(shù)的原理同巴氏消毒法類(lèi)似，但是該技術(shù)的處理溫度為60～100℃，持續(xù)時(shí)間為30min～4d，并且需要加入穩(wěn)定劑防止血漿蛋白的過(guò)度變性。在具體應(yīng)用時(shí)，一般溫度越高，病毒滅活時(shí)間就越短。典型的處理?xiàng)l件包括60℃時(shí)，處理時(shí)間為96h；80℃時(shí)，處理時(shí)間為72h；100℃時(shí)，處理時(shí)間為30min。影響干熱滅活凝血因子中病毒效果的因素很多，如制品中保護(hù)劑的類(lèi)型及其加量、凍干效果等，因此在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程巾要嚴(yán)格操作。此外，干熱法在應(yīng)用時(shí)，其產(chǎn)率較其他技術(shù)而言會(huì)有10%～30%的降幅，產(chǎn)品的可利用性也相應(yīng)降低，進(jìn)而導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。

（五）納米膜過(guò)濾

納米膜過(guò)濾技術(shù)主要利用病毒顆粒與蛋白分子大小差異，通過(guò)納米級(jí)的濾膜將病毒除去。尹惠瓊等通過(guò)PegasusSV4納米膜對(duì)不同企業(yè)提供的5%靜注人免疫球蛋白樣品和重組人源化單克隆抗體樣品進(jìn)行病毒過(guò)濾驗(yàn)證，其中，靜注人免疫球蛋白樣品有效處理量為60～110L/m2，蛋白處理量3.12～5.72kg/m2；重組人源化單克隆抗體樣品的有效處理量為40L/m2。對(duì)于未能檢測(cè)到病毒滴度的樣品，取其最低稀釋倍數(shù)孔上清接種敏感細(xì)胞，盲傳3代，結(jié)果均未觀察到細(xì)胞病變。納米膜過(guò)濾較其他技術(shù)而言，對(duì)血液組成成分的影響更小一些，并且在去除小病毒（<20nm）方面有著顯著的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，但是，其過(guò)濾質(zhì)量很容易受到納米膜生產(chǎn)質(zhì)量和產(chǎn)品品質(zhì)影響，存在過(guò)濾不徹底的可能。

二、發(fā)展趨勢(shì)

對(duì)于血液制品中的病毒滅活，其關(guān)鍵在于在滅活脂包膜和非脂包膜病毒的同時(shí)，還要有效保證蛋白質(zhì)的質(zhì)量。縱觀上文所述的病毒滅活技術(shù)，這些技術(shù)雖然均可以較為有效達(dá)到病毒去活的目的，但是也有著各種各樣的不足，因此，相關(guān)學(xué)者還要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)病毒滅活技術(shù)的研究。而除了上文所述一些常用血液制品病毒滅火技術(shù)以外，另外還有一些滅活工藝雖有較大的不足，但也已實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用，如化學(xué)方法中的辛酸處理法、亞甲藍(lán)光化學(xué)處理法，物理方法中的射線(xiàn)輻照法、紫外線(xiàn)輻照法。其中，紫外線(xiàn)照射將成為未來(lái)病毒滅活方法的優(yōu)選之一，具有以下兩大應(yīng)用優(yōu)勢(shì)：第一，無(wú)論是脂包膜還是非脂包膜病毒，均可實(shí)現(xiàn)高效滅活；第二，紫外線(xiàn)照射滅火過(guò)程不會(huì)引入任何雜質(zhì)，有效避免了二次污染，具有較高的安全性。需要注意的是，該方法在滅活過(guò)程中也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)造成一定的影響，因此，探索紫外照射劑量、尋找更好的蛋白質(zhì)保護(hù)劑是該技術(shù)的關(guān)鍵所在。如果能將此劑量應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中，將大大地提高病毒滅活的效率，節(jié)省時(shí)間。

三、結(jié)束語(yǔ)

總而言之，血液制品安全的重要性是毋庸置疑的，為有效提高血液制品病毒滅活的質(zhì)量和有效性，并且保證其效果，各國(guó)學(xué)者為此做出了巨大努力，并且也找出了眾多的有效方法。需要注意的是，隨著生物的進(jìn)化與發(fā)展，未來(lái)將會(huì)出現(xiàn)更多的病毒種類(lèi)，進(jìn)而威脅到血液制品的安全性，因此需要不斷加強(qiáng)對(duì)血液制品病毒滅活及去除技術(shù)的研究，促進(jìn)血液制品安全性的提升。

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