CDH17對那可丁耐藥性結腸癌細胞裸鼠移植瘤模型的影響*

朱慶曦，黃曉東，劉蒙，韓崢，譚潔，劉維潔，陳巍，田霞

[武漢大學同仁醫院（湖北省武漢市第三醫院) 消化內科，湖北 武漢 430060]

結腸癌是全球常見的消化道惡性腫瘤之一，居世界癌癥相關致死率的第2位，每年約70萬患者死于結腸癌。目前結腸癌的治療是以手術切除為主的綜合治療，化學治療為輔，但是大多數患者在治療后容易復發[1]。市面上有多種抗腫瘤藥物，其中那可丁作為一種外周性鎮咳藥，能抑制肺牽張反射引起的咳嗽[2]。其可通過與微管結合、線粒體途徑誘導部分腫瘤或影響正常細胞周期進程，從而促進細胞凋亡[3-5]。盡管實驗證實那可丁沒有明顯的毒副作用[6-7]，但是腫瘤細胞存在對那可丁產生耐藥性問題。本研究主要探索如何增強那可丁抗腫瘤的作用，同時降低其耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材料

那可丁（美國Sigma-Aldrich公司），逆轉錄試劑盒、熒光染料SYBR試劑盒購自日本TaKaRa公司，Western blot檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），Annexin V、碘化物（propidium iodide，PI）購自美國BioVision公司。

1.2 方法

1.2.1 載體構建 通過軟件設計合成4組針對靶向基因肝腸鈣黏連蛋白（liver-intestine cadherin，CDH17）的pre-siRNA干擾序列，構建帶有綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的siCDH17干擾質粒，鑒定正確后轉染那可丁耐藥性結腸癌細胞，選出干擾效果最好的RNA干擾序列，構建慢病毒表達載體。最終成功完成siCDH17（陽性干擾組）和siNC（非特異性對照組）慢病毒表達載體的構建，慢病毒載體感染細胞感染率高達95%，并且作用時間長。

1.2.2 實時聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR） 以 人 β-actin作為內參，CDH17正向引物：5’-GGACAGAGAAGC CGGAAGTC-3’；反向引物 5’-GAACAAGCCCGTG TAGTCCTT-3’。根據SYBR Premix Taq試劑盒說明書進行real-time PCR檢測，PCR反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性1 min，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，共40個循環，72℃繼續延伸8 min，最后保存于4℃。

1.2.3 Western blot檢測 藥物作用時間結束后，收集細胞，進行常規細胞裂解提取并測定總蛋白濃度。取40μg蛋白加熱變性10 min后進行SDS-PAGE電泳，然后轉移到硝酸纖維素膜上。轉膜結束后加脫脂奶粉封閉，4℃過夜。使用TBST洗滌3次，分別加入一抗CDH17（ab109190）（1∶1 000）和GAPDH（ab9485）（1∶2 500）抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌，加入辣根過氧化物酶標記的二抗IgG（1∶5 000），25℃孵育1 h，使用電化學發光試劑盒顯色，X射線片曝光。每份樣品檢測重復3次。

1.2.4 腫瘤異種移植模型 將裸鼠隨機分成空白組、非特異性對照組、陽性干擾組，每組7只。在裸鼠右側背部皮下接種人結腸癌細胞懸液，復制裸鼠移植瘤模型，當瘤體積達100～150 mm3時，每3天注射5 mg/kg那可丁，同時每3天觀察移植瘤生長情況，進行瘤重和瘤體積的比較。

1.2.5 末端標記法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL） 采用TUNEL檢測細胞凋亡。將材料用二甲苯浸洗2次，5 min/次，過梯度酒精，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗2次，用細胞通透液處理8 min，PBS漂洗3次，加入蛋白酶K，雙蒸水漂洗后用3%過氧化氫封閉，加入dUTP和過氧化氫酶培養后進行觀察。當基因組DNA斷裂時，在暴露的3’端加入異硫氰酸熒光素，通過熒光顯微鏡或者流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒載體干擾CDH17的表達

2.1.1 CDH17 mRNA 空白組、非特異性對照組、陽性干擾組的CDH17 mRNA相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，非特異性對照組與空白組CDH17 mRNA表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；陽性干擾組與空白組比較，CDH17 mRNA表達量降低（P＜0.05）。見表 1。

2.1.2 CDH17蛋白 空白組、非特異性對照組、陽性干擾組的CDH17蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較經SNK-q檢驗，陽性干擾組的CDH17蛋白表達受到抑制，較空白組和非特異性干擾組降低（P＜0.05）；非特異性對照組與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。mRNA和蛋白水平結果說明，轉染慢病毒表達載體成功干擾CDH17的表達。見表1和圖1。

2.2 下調CDH17基因抑制結腸癌細胞增殖

2.2.1 腫瘤體積 空白組、非特異性對照組、陽性干擾組腫瘤異種移植模型在移植后2、4、6、8、12和16 d的腫瘤體積比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點動物體內腫瘤體積有差別（F=14.582，P=0.000）。從第6天開始，陽性干擾組與空白組、非特異性對照組腫瘤體積比較，差異有統計學意義（P＜0.05），陽性干擾組腫瘤體積大于空白組和非特異性對照組。②3組動物體內腫瘤體積有差別（F=189.081，P=0.000），陽性干擾組較空白組、非特異性對照組動物體內腫瘤體積小（P＜0.05），抑瘤效果較好；非特異性對照組與空白組動物體內腫瘤體積比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。③3組腫瘤體積變化趨勢有差異（F=5.731，P=0.018）。見表2和圖2。

表1 各組CDH17 mRNA和蛋白的表達水平比較 （n =7，±s）

表1 各組CDH17 mRNA和蛋白的表達水平比較 （n =7，±s）

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與非特異性對照組比較，P ＜0.05

組別 CDH17 mRNA CDH17蛋白空白組 1.002±0.068 0.861±0.006非特異性對照組 0.910±0.085 0.851±0.008陽性干擾組 0.217±0.0761）2） 0.229±0.0091）2）F值 94.676 4165.432 P值 0.000 0.000

圖1 慢病毒載體干擾CDH17蛋白的表達

2.2.2 腫瘤重量 移植后16 d，空白組、非特異性對照組、陽性干擾組動物模型體內腫瘤重量分別為（0.956±0.023）、（0.908±0.026）和（0.321±0.037）g，經單因素方差分析，差異有統計意義（F=304.337，P=0.000），陽性干擾組腫瘤重量低于空白組和非特異性對照組。見圖3。

2.3 下調CDH17基因促進細胞凋亡

利用慢病毒表達載體干擾結腸癌細胞，與空白組結腸癌細胞和慢病毒干擾載體結腸癌非特異性對照組相比，TUNEL檢測發現陽性干擾組腫瘤異種移植模型體內結腸癌細胞凋亡數明顯增多。見圖4。

表2 各組不同時間點動物模型體內腫瘤體積比較 （n =7，mm3，±s）

表2 各組不同時間點動物模型體內腫瘤體積比較 （n =7，mm3，±s）

注：1）與空白組比較，P ＜0.05；2）與非特異性對照組比較，P ＜0.05

組別 2 d 4 d 6 d 8 d 12 d 16 d空白組 107.712±17.371 206.997±27.176 339.189±32.375 614.772±79.036 923.893±80.393 1382.926±92.188非特異性對照組 106.418±15.147 205.290±26.383 333.373±29.674 593.399±64.778 912.509±60.511 1299.444±74.942陽性干擾組 107.781±14.307 207.926±20.681 238.861±25.7011）2） 256.232±49.5841）2） 288.722±58.9791）2） 303.473±56.5291）2）

圖2 各組動物模型體內腫瘤體積不同時間點變化趨勢（±s）

圖3 各組動物模型體內腫瘤重量比較 （n =7，±s）

圖4 各組細胞凋亡情況 （×200）

3 討論

近年來結腸癌患者的生存率無明顯改善，且發病率呈上升趨勢，每年新增900萬確診病例，其中東歐、南美和東亞地區發病率最高[8]。我國結腸癌的發病率較高，其致死率高于其他惡性腫瘤[9]。隨著分子生物學的發展，以及人類對疾病與基因關系認識的提高，聯合化學治療的基因治療得到越來越多的認可。化學基因治療可以增加腫瘤細胞對化學藥物的敏感性，而腫瘤基因治療即針對腫瘤發生、發展過程中的遺傳性背景，明確缺失、突變等缺陷基因的作用，過表達或者下調腫瘤細胞，以及其他體細胞中特定基因已補償或者糾正錯誤基因，達到治療腫瘤的目的。

細胞間的黏附機制在腫瘤侵襲轉移過程中起雙重作用。一方面腫瘤細胞必須先從其原發病灶黏附部位脫離，故黏附可抑制侵襲；另一方面，腫瘤細胞需要從連續的黏附和去黏附過程中獲得牽引力來進行移動。細胞黏附分子與腫瘤的侵襲轉移密切相關，起至關重要的作用。CDH17是鈣黏連蛋白超家族中結構特殊的一員，是對經典鈣黏連蛋白和橋粒鈣黏連蛋白功能的補充，CDH17通常在人腸道上皮細胞及部分胰管上皮細胞中表達[10-11]。目前還沒有CDH17在正常人結腸癌中表達的報道，而其在胃癌、肝癌中都有表達[12-14]，這說明CDH17可能在腫瘤進程中扮演重要角色，與結腸癌的發生密切相關。

近幾年國內針對那可丁對腫瘤細胞的影響有所研究，有研究者通過那可丁聯合順鉑作用于體外培養人卵巢癌SKOV3細胞，結果顯示那可丁可以協同順鉑作用于SKOV3細胞，并提高順鉑對SKOV3細胞的敏感性[15]。在針對卵巢癌的研究過程中發現，那可丁可以通過抑制介導腫瘤生存的關鍵因子—低氧誘導因子-1，提高卵巢癌細胞對化療藥物的敏感性[16]。已經證實，那可丁作為抗癌新藥能通過線粒體途徑促進腫瘤細胞的凋亡，但具有耐藥性，如何能增強那可丁抗腫瘤的作用，同時降低其耐藥性是本實驗的主要內容。

本實驗從動物模型探討下調CDH17基因表達對那可丁耐藥的結腸癌細胞的抑制作用。實驗結果從基因和蛋白水平分別驗證siCDH17慢病毒載體的成功構建。小鼠模型是可以進行腫瘤臨床和基礎研究的主要方法，涉及各個領域。實驗結果說明，siCDH17對動物模型體內腫瘤的發生、發展有較好的抑制作用。為研究siCDH17對耐藥性結腸癌細胞的影響，采用TUNEL結合Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡情況。TUNEL檢測結果顯示，陽性干擾組細胞凋亡數量遠多于其他兩組。有研究發現，CDH17的表達與人胃癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌有相關性，CDH17的表達水平在腸型癌癥組織中比肝、胃型癌組織要高[10]。

綜上所述，本實驗結果表明，下調CDH17基因對那可丁耐藥的結腸癌細胞具有明顯的抑制作用，主要表現在早期細胞的凋亡及后續發展上。本研究在分子水平上探討CDH17在耐藥性腫瘤中的作用，是對臨床治療腫瘤新藥物耐藥性的研究，也是對前人在腫瘤分子機制方面研究的基礎上，在臨床藥物方面的延伸，為臨床治療耐藥性腫瘤提供相關數據及研究方向。