人星狀病毒1型野毒株的培養及生物學鑒定*

梁雪雪，劉鵬飛，譚李倩，李明，趙微

（錦州醫科大學，遼寧 錦州 121001）

人星狀病毒（human astrovirus，HAstV）為無囊膜、單股、正鏈RNA病毒，是導致嬰幼兒、老人及免疫缺陷人群腹瀉的重要病原體[1]。HAstV具有8個傳統的血清型（HAstV 1～8），其中HAstV-1型在全世界范圍內廣泛流行[2]。目前，國內HAstV的研究報道局限在流行病學分析，有關病毒的分離方法及生物學特性報道較少。本文對HAstV-1型野毒株進行細胞適應性培養及生物學鑒定，為后續深入研究星狀病毒的分子致病機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與病毒

Caco-2細胞（美國ATCC細胞庫），35份腹瀉患兒糞便樣本來源于遼寧省某市私立幼兒園群體腹瀉樣本，并由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

DMEM培養基、胎牛血清（Cell Culture Companion，美國Gibco公司），HAstV抗體（8E7）為小鼠單克隆抗體（美國Santa Cruz Biotechnology公司），HAstV、輪狀病毒、諾如病毒、腺病毒酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 檢測試劑盒購自丹麥Dako Diagnostics公司，FITC標記的羊抗鼠IgG、豬胰酶及胰酶抑制劑購自美國Sigma-ALDRICH公司和中國上海分公司；病毒RNA抽提試劑盒（德國Qiagene公司），逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RTPCR）和實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）相關分子生物學試劑購自大連寶生生物工程公司有限公司，基因測序由上海杰李生物測序公司完成。

1.3 HAstV的鑒定

糞便樣本經過PBS漩渦離心處理后取上清液作為第一代野毒株P1，采用ELISA試劑盒檢測樣本中HAstV、輪狀病毒、諾如病毒、腺病毒。提取病毒RNA，采用病毒的特異性引物分別對HAstV、輪狀病毒、諾如病毒、腺病毒進行RT-PCR定性檢測，引物序列參考文獻[3-4]。

1.4 HAstV在Caco-2上的擴增及適應性培養

將Caco-2細胞接種于6孔板，長至單層，取500μl HAstV P1代野毒株上清液，加入豬胰酶（終濃度100～200μg/ml），于37℃激活60～90 min后，加入同量的豬胰酶抑制劑。病毒加入細胞前，細胞饑餓培養4 h，將病毒液加入細胞表面吸附60～90 min后，棄去病毒，用PBS洗2次，加入無血清培養基DMEM持續培養，96 h后用細胞刮刀收集所有細胞及細胞培養液，-70℃凍存。感染后的細胞及細胞培養液經過3次反復凍融后，使病毒釋放，4℃離心，棄細胞碎片，收集上清液作為第2代病毒（P2）進行擴增。按照上述方法經過10次（P1～P10）擴增傳代及適應性培養。

1.5 qRT-PCR

采用SYBR染料法檢測每一代次HAstV的拷貝數。HAstV正向引物：5-CCGAGTAGGATCGAG GGT-3，HAstV反向引物：5-GCTTCTGATTAAATCAAT TTTAA-3，擴增HAstV衣殼蛋白ORF2特異性基因，擴增產物88 bp。擴增產物經過回收純化后構建標準質粒，采用核酸分光光度計檢測質粒濃度，并根據公式基因拷貝數/（copies/ml）=（6.02×1023/mol×質粒濃度g/ml）/分子量（MWg/mol），計算標準質粒DNA拷貝數，建立DNA標準品質粒。標準品質粒進行10倍梯度稀釋，每個樣本重復3次，以Ct值為橫坐標，以log基因拷貝數為縱坐標，建立標準曲線。采用qRT-PCR儀（BIORAD IQ5）對病毒基因拷貝數進行測定。

1.6 免疫熒光法

采用免疫熒光法檢測病毒抗原。將Caco-2細胞接種于6孔板，取第6代病毒液（P6）按照上述方法感染細胞，采用4%多聚甲醛固定，經過打孔、封閉后，一抗加入HAstV 8E7抗體（1∶1 000，8E7為小鼠單克隆抗體），二抗為FITC標記的山羊抗小鼠抗體（1∶500）。熒光顯微鏡下觀察細胞內HAstV熒光灶。

1.7 病毒基因穩定性檢測

分別提取P1～P10代病毒液RNA，經過逆轉錄后，采用PCR方法擴增HAstV衣殼蛋白特異性基 因ORF2。ORF2正 向 引 物 ：5-ATGGCTAGCAA GTCCAATAAGCA-3，ORF2反向引物：5-CTACTCGG CGTGGCCGCGGCTTCC-3，擴增產物2 364 bp。擴增產物經過瓊脂糖電泳檢測，回收純化，構建到PMD-18T載體中，轉化大腸桿菌，經過擴增培養后提取質粒，送上海杰李生物測序公司測序。

1.8 熒光灶法

采用熒光灶法檢測病毒滴度。將Caco-2細胞按1×104個/ml的密度接種于96孔板，再加入10倍系列稀釋的病毒感染細胞上清（50μl/孔），按照1.4中的方法感染細胞，96 h后棄去病毒液，加入4%多聚甲醛4℃固定30 min；棄去固定液，加入抗HAstV熒光抗體8E7（1∶1 000稀釋）50μl/孔，37℃中和1 h；PBS清洗后，加入FITC標記的羊抗鼠IgG（1∶500），37℃孵育1 h，PBS沖洗后，在熒光顯微鏡下觀察，計算終末稀釋孔熒光灶個數，并計算病毒滴度。病毒滴度（FFU/ml）=（最高稀釋倍數孔熒光灶個數的平均值+相鄰較低稀釋倍數孔熒光灶個數的平均值）/2×相鄰較低稀釋倍數×每孔加入的病毒稀釋液的體積。

1.9 統計學方法

繪制qRT-PCR標準曲線，基因拷貝數取Log對數作為因變量，Ct值作為自變量，應用直線回歸法。

2 結果

2.1 HAstV的定性結果

35份腹瀉樣本經過PBS處理后ELISA結果表明，HAstV感染率為85.7%（30/35），未檢出其他病毒的感染。RT-PCR檢測結果表明，HAstV檢出率為100%。將所有樣本進行基因測序，結果檢測出15株HAstV（GenBank No.KF211460–KF211474），經過序列分析對比及遺傳進化分析，確認分離的毒株屬于HAstV-1d亞型[5]。本研究中選取其中1株毒株編號JZ-10作為P1代野毒株進行后續研究。

2.2 HAstV的適應性培養、增殖及抗原檢測結果

HAstV JZ-10接種Caco-2細胞傳代到第10代，未觀察到明顯的細胞病變。但通過免疫熒光法檢測細胞內的病毒感染情況，表明JZ-10毒株在Caco-2細胞連續傳10代，在接種病毒的細胞內均檢測到明亮的綠色病毒特異性熒光，而對照組細胞內未見綠色熒光（以第6代病毒為例）（見圖1）。表明HAstV已經適應在Caco-2內的復制，且具有良好的抗原性。毒株適應細胞的最佳培養條件為：毒株感染前加入終濃度為200μg/ml的豬胰酶，于37℃激活90 min后再加入同量的豬胰酶抑制劑。激活的病毒液加入細胞表面吸附90 min后，棄去病毒，維持培養液中不加血清，維持培養96 h后收取全部細胞及上清液。經過3次反復凍融使病毒釋放，4℃離心，棄去細胞碎片，收集上清液作為下一代病毒。

圖1 JZ-10毒株P6代感染Caco-2細胞 （免疫熒光×20）

2.3 細胞內HAstV的拷貝數

采用HAstV熒光定量引物進行PCR擴增后出現88 bp的目的片段，回收目的片段克隆測序進行序列比對，結果顯示該片段與HAstV-1ORF2基因相似性為100%。建立標準質粒PMD18-T-ORF2，質粒濃度458.3μg/ml。根據公式計算出質粒的基因拷貝數為1.5×1011copies/ml。質粒按照10倍梯度稀釋后行qRT-PCR檢測，根據擴增結果繪制Ct值標準曲線，log基因拷貝數=-0.3141（Ct）+13.87，決定系數R2=0.997，Tm值（85±0.05）℃（見圖2）。JZ-10毒株基因拷貝數結果見附表，隨著病毒傳代次數的增加，HAstV的拷貝數增加，P9代和P10代達最高峰，基因拷貝數達1×107。

圖2 qRT-PCR標準曲線

附表 HAstV JZ-10毒株基因拷貝數

2.4 HAstV特異性基因穩定性鑒定結果

提取P1～P10培養物的RNA，采用RT-PCR擴增HAstV衣殼蛋白全長基因ORF2，同時設立陰性對照組和陽性對照組。經瓊脂糖凝膠電泳分析，可見2 364 bp的特異性基因片段（見圖3）。經過測序分析，P1～P10代基因序列一致，無突變現象，基因序列穩定。

圖3 HAstV衣殼蛋白全長基因ORF2 RT-PCR擴增產物

2.5 HAstV的感染滴度

HAstV-1型JZ-10株在Caco-2細胞上連續傳10代，病毒的感染性滴度呈持續升高直至穩定適應過程，第1、2代病毒滴度最低，傳至第3代時，病毒的感染性滴度開始增加，達3.3 logFFU/ml；至第9、10代，病毒滴度最高，達6.97 LogFFU/ml（見圖4）。

圖4 HAstV-1型JZ-10毒株不同代次感染性滴度

3 討論

小兒腹瀉是全球性的重要公共衛生問題之一，除輪狀病毒、杯狀病毒和腺病毒以外，HAstV是也一個引起兒童病毒性腹瀉的重要致病因子[6]。近10年來，我國嬰幼兒感染HAstV的檢出率逐年增加；2010年，國內幼兒園及產科病房新生兒HAstV感染性腹瀉的爆發引起兒科的高度重視[7]。HAstV與其他腸道病毒，如諾如病毒、輪狀病毒、腺病毒等混合感染，延長患者的治愈周期，增加患者的死亡率，已成為公共衛生問題[8]。本實驗分析HAstV-1型毒株在Caco-2細胞上的適應性及毒株的生物學特性，為后續研究病毒的分子生物學機制及疫苗研發奠定基礎。

HAstV具有獨特的生物學特性，由于病毒感染細胞后，沒有明顯的細胞病變，因此給病毒的分離培養及滴度檢測帶來困難。本課題組前期在幼兒園腹瀉群體樣本中分離出1株HAstV-1型，根據病毒的生物學特性，進行病毒分離與細胞的適應性培養。文獻報道，Caco-2細胞能夠支持HAstV株的復制和感染，已成為研究HAstV感染的標準細胞系[9]。一些腸道病毒在體外細胞培養時都需要胰酶的存在，如小兒輪狀病毒[10]。本文實驗最終采用終濃度為200μg/ml的豬胰酶，于37℃激活90 min后進行病毒感染，在細胞的傳代過程中，每次接種病毒都要進行胰酶的激活處理，胰酶的活性作用可以使病毒粒子激活，形成具有感染性的病毒粒子，并能夠維持病毒在細胞內具有一定的感染滴度。本實驗結果表明，JZ-10毒株經過10代的細胞適應性培養后，雖然未出現可見的CPE，但是免疫熒光檢測結果提示，HAstV已經適應在Caco-2內的復制，在無血清DMEM維持培養時，細胞不脫落，免疫熒光檢測病毒能夠識別HAstV單克隆抗體，具有良好的抗原性。而本實驗采用Caco-2細胞進行病毒的分離培養，該細胞的功能和分泌與小腸上皮細胞類似，并能夠形成隱窩結構，因此HAstV感染Caco-2后的致病作用與天然病毒感染類似。

病毒滴度測定是HAstV在后續研究實時處理因素中的重要步驟。目前測定病毒滴度的方法有多種，一類是對病毒粒子進行物理定量；一類是生物學方法，如空斑滴定法、50%細胞組織感染法、免疫熒光法等。由于HAstV感染細胞后不能觀察到明顯的細胞病變，因此本實驗采用微量免疫熒光灶法測定病毒滴度，通過HAstV一抗孵育，FITC標記的二抗雜交，利用熒光顯微鏡觀察發光細胞的數量，判斷細胞的感染量。該方法有效檢測出HAstV的滴度，隨著傳代次數的升高，病毒滴度增加，病毒感染滴度可以滿足后續實驗的需要。同時本實驗采用qRT-PCR對病毒在細胞內增殖情況進行檢測，病毒的基因拷貝數能夠反映病毒在宿主細胞內的復制情況和宿主細胞的感染性。該方法能夠較為精確地反映病毒中的病毒顆粒數。本實驗中，病毒的基因拷貝數與病毒的滴度呈正相關，且隨著傳代次數增加，病毒基因組保持穩定。

通過本實驗HAstV的適應性培養與增殖研究，獲得能夠在實驗室中分離培養的細胞適應性HAstV-1毒株，該毒株的獲得為后續進行HAstV的研究奠定了基礎。