MicroRNA-192、ZEB1對膀胱癌上皮-間質轉化的影響

井崗山，江志強

（1.山東省肥城礦業中心醫院，山東 肥城 271608；2.山東省即墨市人民醫院，山東 即墨 266200）

膀胱癌作為常見的惡性腫瘤，發病率位居泌尿系統惡性腫瘤首位，具有多發、易復發等特點，且復發后腫瘤惡性程度增加，嚴重威脅人類健康[1]。目前，該腫瘤的發病及復發機制尚不清楚。microRNA（miRNA）作為一類高度保守的非編碼短小RNA，在細胞增殖、分化、凋亡、器官發育、免疫等多種生理功能中發揮重要作用，亦參與多種惡性腫瘤發生、發展及轉移過程[2]。研究表明，膀胱癌患者外周血miRNA表達譜發生異常[3]。microRNA-192（miR-192）作為miRNA重要類型，在多種惡性腫瘤組織中表達異常，參與腫瘤發生、發展過程[4]。亦有研究指出，miR-192表達失調可能在上皮-間質轉化（epithelialmesenchymal transition, EMT）過程中發揮重要作用[5]。而EMT參與與惡性腫瘤細胞增殖、遷移及耐藥過程。本研究對膀胱癌組織中miR-192、EMT相關指標進行檢測，并與正常膀胱黏膜組織進行比較，探討其在膀胱癌發生、發展中的意義，為膀胱癌機制研究提供基礎資料。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年5月-2015年6月在山東省肥城礦業中心醫院泌尿外科擇期行手術治療的膀胱癌患者96例作為膀胱癌組，均經病理學診斷證實為膀胱上皮移形細胞癌。其中，男性62例，女性34例；年齡37～74歲，平均（63.8±9.7）歲；初發腫瘤62例，復發腫瘤34例；單發腫瘤55例，多發腫瘤41例；病理學分級：高分化32例，中低分化64例；TNM分期：T0、T1期38例，T2～T4期58例。同期留取外傷性膀胱破裂患者正常膀胱黏膜組織41例作為對照組，均經病理學診斷證實為正常膀胱黏膜組織。其中，男性29例，女性12例；平均年齡（61.9±8.2）歲。兩組患者性別、年齡等一般情況比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。將留取的膀胱癌及正常膀胱黏膜組織迅速放入液氮中，保存于-80℃冰箱以備檢。本研究通過本院倫理委員會批準，所有患者知情同意。

1.2 主要試劑及設備

Trizol總RNA提取試劑盒（美國Invitrogen公司），逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒購自上海拜力生物科技公司，miR-192及內參U6、鋅指結構轉錄因子1（zinc finger transcription factor 1, ZEB1）及內參β-actin引物序列由上海生工生物工程股份有限公司設計合成，兔抗人ZEB1多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），鼠抗人E鈣黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗體（北京中杉公司），鼠抗人波形蛋白（Vimentin）單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）儀（美國ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 qRT-PCR 采用qRT-PCR檢測不同組織中miR-192和ZEB1基因的表達。取凍存組織，研磨后加入細胞裂解液，用Trizol總RNA提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計檢測總RNA，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。逆轉錄獲得模板單鏈cDNA，以cDNA為模板進行PCR。miR-192正向引物 ：5’-CTGACCTATGAATTGACAGCC-3’，反向引物：5’-CAGTGCAGGGTCCGACCTATT-3’；U6正向引物：5’-TCAGTTTGCTGTTCTGGGTG-3’，反向引物：5’-CGGTTGGCTGGAAAGGAG-3’；ZEB1正向引物：5’-GCACAACCAAGTGCAGAAGA-3’，反向引物：5’-CATTTGCAGATTGAGGCTGA-3’；β-actin正向引物：5’-TGGCACCACACCTTCTACA-3’，反向引物：5’-AGCACAGCCTGGATAGCA-3’。PCR反應條件：94℃預變性1 min，92℃變性30 s，56℃退火30 s，74℃延伸30 s，共40個循環。每個樣品設置3個平行反應復孔。采用2-△△Ct法計算組織中miR-192和ZEB1基因的相對表達量。

1.3.2 免疫組織化學法 采用免疫組織化學法檢測不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin的表達。取不同組織，用4%甲醛固定后，石蠟包埋、切片，厚約5μm。經脫蠟、水化、微波抗原修復、過氧化氫孵育，滴加一抗兔抗人ZEB1、E-cadherin和Vimentin多克隆抗體（稀釋比例1∶300、1∶800和1∶1 000），4℃濕盒過夜孵育，加入通用型二抗，37℃濕盒孵育30 min。二氨基聯苯胺顯色劑顯色，蘇木精復染，分化、返藍、脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。結果判定：ZEB1主要以細胞質和細胞核出現黃色或棕黃色團塊狀或顆粒狀染色為陽性，E-cadherin和Vimentin主要以細胞膜出現黃色、棕褐色均質染色為陽性。在高倍鏡下隨機選取5個視野，根據著色細胞比例進行判定：＜90%為表達異常，≥90%為表達正常。

1.3.3 Western blot檢測 采用Western blot檢測不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表達。取組織研磨后加入細胞裂解液，對總蛋白進行提取，用BCA法對蛋白濃度進行檢測。取蛋白30μg，用10% SDS-PAGE進行電泳分離，經電轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉在室溫下封閉60 min，分別加入一抗兔抗人ZEB1多克隆抗體、鼠抗人E-cadherin多克隆抗體和鼠抗人Vimentin單克隆抗體（稀釋比例分別為1∶500、1∶1 200和1∶2 000），過夜孵育，用TBST漂洗3次，將HRP標記的IgG二抗加入（稀釋比1∶1 000），室溫下孵育60 min，TBST漂洗3次，ECL化學發光顯色液顯色。采用Quantity One圖像分析軟件對獲得的電泳條帶進行分析，計算不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的相對表達量。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗，相關性分析用Pearson法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同組織中miR-192和ZEB1基因表達水平比較

2.1.1 miR-192 膀胱癌與對照組組織中miR-192相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），膀胱癌組織中miR-192相對表達量低于對照組。見表1。

2.1.2 ZEB1 mRNA 膀胱癌與對照組組織中ZEB1 mRNA相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），膀胱癌組織中ZEB1 mRNA相對表達量高于對照組。見表1。

表1 不同組織中miR-192和ZEB1基因表達水平比較（±s）

表1 不同組織中miR-192和ZEB1基因表達水平比較（±s）

組別 miR-192 ZEB1 mRNA膀胱癌組（n =96） 0.58±0.07 0.61±0.09對照組（n =41） 0.93±0.11 0.32±0.06 t值 23.686 18.279 P值 0.000 0.000

2.2 膀胱癌組織中miR-192和ZEB1基因表達水平與臨床病理特征的關系

膀胱組織中miR-192和ZEB1 mRNA表達水平與年齡、性別、發病階段、腫瘤數量及腫瘤大小無關（P＞0.05），與病理學分級、TNM分期及是否淋巴結轉移有關（P＜0.05）。見表 2。

2.3 不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表達

免疫組織化學染色結果顯示，ZEB1主要表達于細胞質和細胞核，在膀胱癌組織中呈高表達；E-cadherin主要表達于細胞膜，在膀胱癌組織中呈低表達；Vimentin主要表達于細胞膜，在膀胱癌組織中呈高表達。見圖1。

2.4 不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平比較

Western blot結果顯示，膀胱癌和對照組組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），膀胱癌組織中ZEB1和Vimentin蛋白表達水平高于對照組，E-cadherin蛋白表達水平低于對照組。見表3和圖2。

2.5 膀胱癌組織中miR-192與ZEB1、E-cadherin、Vimentin蛋白表達水平的相關性

Pearson相關性分析顯示，膀胱癌組織中miR-192與ZEB1、Vimentin蛋白表達水平呈負相關（r=-0.279和-0.318，均P=0.000），與E-cadherin蛋白表達水平呈正相關（r=0.376，P=0.000）。

表2 不同影響因素膀胱癌組織中miR-192和ZEB1基因表達水平比較

圖1 不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表達 （免疫組織化學法×20）

表3 不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平比較 （±s）

表3 不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平比較 （±s）

組別 ZEB1蛋白 E-cadherin蛋白 Vimentin蛋白膀胱癌組（n =96） 1.27±0.15 0.51±0.10 1.34±0.13對照組（n =41） 1.09±0.12 0.78±0.14 1.12±0.11 t值 6.515 11.770 7.594 P值 0.000 0.000 0.000

圖2 不同組織中ZEB1、E-cadherin和Vimentin蛋白的表達

3 討論

膀胱癌作為泌尿系統常見惡性腫瘤，發病率高、復發率高，且每次復發后惡性程度常增加[6]。有研究指出，miRNA參與膀胱癌的發生、發展過程，且與膀胱癌復發有關[7]。miR-192作為miRNA類型之一，參與胃癌[8]、肺癌[9]、子宮內膜癌[10]等多種惡性腫瘤發生、發展過程。亦有研究指出，miR-192過表達可抑制人膀胱癌細胞增殖，誘導凋亡[11]。本研究結果顯示，膀胱癌組織中miR-192表達水平低于對照組，說明miR-192在膀胱癌組織中呈低表達，可能參與膀胱癌發生過程；膀胱組織中miR-192表達水平與病理學分級、TNM分期、是否淋巴結轉移有關，病理學分級越低、TNM分期越高、發生淋巴結轉移，miR-192表達水平越低，進一步說明miR-192低表達參與膀胱癌發生、發展、轉移過程，可能發揮抑癌基因功能。

有研究表明，EMT在腫瘤細胞原位浸潤及遠處轉移中發揮重要作用。EMT出現異常時，可導致細胞表型及結構發生改變，使上皮細胞極性喪失、間質特性增強，從而使細胞間黏附力減弱甚至消失，加速細胞遷移及轉移[12]。ZEB1作為EMT過程中重要的轉錄調控因子，可通過與E盒位點結合而參與EMT過程[13]。本研究結果顯示，膀胱癌組織中ZEB1 mRNA和蛋白表達水平高于對照組，說明ZEB1在膀胱癌組織中表達異常，且病理學分級越低、TNM分期越高、發生淋巴結轉移，ZEB1 mRNA表達水平越高，說明ZEB1在膀胱癌組織中呈高表達，可能通過EMT過程而參與膀胱癌發生、發展及轉移。E-cadherin作為介導細胞間黏附的跨膜糖蛋白，其表達降低或缺失可使細胞間黏附力降低，是EMT發生的標志[14]。Vimentin蛋白作為纖維蛋白，是EMT發生的重要標志物，其表達水平越高往往預示腫瘤惡性程度越高[15]。本研究結果顯示，膀胱癌組織中Vimentin蛋白表達水平高于對照組，而E-cadherin蛋白表達水平低于對照組，進一步說明EMT可能參與膀胱癌侵襲、轉移過程。Pearson相關性分析顯示，膀胱癌組織中miR-192與ZEB1、Vimentin蛋白表達水平呈負相關，與E-cadherin蛋白表達水平呈正相關，說明miR-192低表達可能通過負性調控ZEB1而參與EMT過程，從而促使膀胱癌發生、發展及轉移。

綜上所述，miR-192在膀胱癌組織中呈低表達，而ZEB1呈高表達，miR-192可能通過負性調控ZEB1，促進EMT過程，從而加速膀胱癌的浸潤和轉移。