帕金森病患者血漿氧化應激生物標志物水平研究

趙振華，汪效松，魏振，何瑩超，程瓊，汪銀洲

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是常見的神經系統變性疾病之一，臨床表現包括靜止性震顫、肌強直、運動遲緩等運動癥狀以及抑郁、認知障礙、自主神經功能異常等非運動癥狀［1］。PD起病隱匿，疾病早期可無明顯臨床癥狀，診斷較為困難，但是早期使用神經保護治療可以減少神經元變性，從而延緩疾病進展。一旦進入疾病中晚期，臨床癥狀明顯，雖然診斷較為容易，但是殘余神經元已極少，藥物治療的“蜜月期”較短，效果欠佳，并且容易出現各種并發癥。因此，PD早期診斷對疾病治療、延緩疾病發展及監測疾病變化至關重要，尋找靈敏度和特異度高的診斷方法和合適的生物標志物迫在眉睫。目前，各國學者都致力于尋找高靈敏度和特異度的生物學標志物，用于輔助PD的早期診斷和客觀評估疾病的嚴重程度。氧化應激在PD發病機制中扮演了重要角色［2］。氧自由基（ROS）的生成過多或者清除障礙是PD患者多巴胺能神經元丟失的一個重要因素，ROS異常增多的原因包括多巴胺代謝異常、自由基清除能力降低、離子水平紊亂及鈣超載［3］。此外，線粒體功能障礙可影響呼吸鏈復合物Ⅰ的正常功能，進而導致三磷酸腺苷（ATP）的合成障礙，同時使ROS生成增加，異常增多的ROS又可以導致線粒體DNA的損傷并觸發線粒體損傷與氧化應激之間形成惡性循環［4］。因此，氧化應激可能成為反映PD疾病狀態的靈敏指標。本研究旨在探討PD患者外周血漿氧化應激的標志物丙二醛（malonaldehyde，MDA）、8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2-deoxyguanosine，8-OHdG）、DJ-1蛋白水平，以期為氧化應激指標在PD的診斷和疾病不同階段評估的臨床應用價值提供新的參考依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年12月—2017年6月于福建省立醫院神經內科門診就診及住院的原發性PD患者40例。納入標準：（1）均符合PD的臨床診斷標準［5］；（2）年齡60～80歲。排除標準：（1）進行性核上性麻痹、多系統萎縮、皮質基底核變性等PD疊加綜合征；（2）阿爾茨海默病或有嚴重精神疾病史；（3）合并嚴重心、腦、肺、肝、腎、血液、內分泌代謝疾病及腫瘤。另于同期在本院收集與PD患者無血緣關系的健康體檢者40例為對照組。納入標準：（1）年齡60～80歲；（2）無震顫、行動遲緩、肌強直等表現；（3）無神經系統疾病史及PD家族史。排除標準：（1）認知功能下降、阿爾茨海默病或有嚴重精神疾病史；（2）合并嚴重心、腦、肺、肝、腎、血液、內分泌代謝疾病及腫瘤。本研究經福建省立醫院倫理委員會批準，所有受試者知情并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 病程評價 采用Hoehn-Yahr（H-Y）分期評估病情嚴重程度。分別為：Ⅰ期：單側受影響；Ⅱ期：雙側受影響但無姿勢平衡障礙；Ⅲ期：出現姿勢平衡障礙，常常容易跌倒；Ⅳ期：日常生活需要人照護，獨立行走有困難；V期：幾乎全天須依賴輪椅，或者終日無法起身［6］。將Ⅰ～Ⅱ期的患者歸為早期PD組（n=23），Ⅲ期及以上的患者歸為中晚期PD組（n=17）。

1.2.2 統一帕金森病評定量表第3部分（UPDRS-Ⅲ）測評 旨在評價PD患者的運動障礙程度，包括言語、面部表情、靜止性震顫、手部動作性/姿勢性震顫、強直、手指拍打試驗、手動作、輪替動作、腿部靈活性、坐椅起立、姿勢、步態、姿勢平衡、軀體少動14個條目，每個條目分為5個等級，分別計為0～4分，分數越高，運動障礙越嚴重［7］。

1.2.3 實驗室指標檢測 由本院護士清晨抽取5 ml患者空腹肘靜脈血，常規分離血漿，置于-80 ℃冰箱保存備用。采用硫代巴比妥酸法檢測血漿中MDA水平，采用ELISA法檢測血漿中8-OHdG、DJ-1蛋白水平。操作步驟均嚴格按照說明書進行。MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所，8-OHdG ELISA試劑盒購自美國Abcam公司，DJ-1蛋白ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料以（x ±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組基本情況比較 3組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；早期、中晚期PD組UPDRS -Ⅲ評分、病程比較，差異有統計學意義（P＜0.05，見表1）。

表1 3組基本情況比較Table 1 Demographic characteristics of the participants

2.2 3組血漿氧化應激指標水平比較 3組血漿MDA、8-OHdG水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中，早期、中晚期PD組MDA水平高于對照組，早期PD組8-OHdG水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。3組血漿DJ-1蛋白水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表2）。

表2 3組血漿氧化應激指標水平比較（x±s，μg/L）Table 2 Levels of MDA，8-OHdG and DJ-1 protein in the controls，mild PD patients and moderate-to-severe PD patients

3 討論

PD是一種常見的中樞神經系統變性疾病，PD的主要病理學特點是腦黑質中多巴胺能神經元變性壞死，黑質紋狀體通路退化，而導致這一改變的確切病因尚不十分清楚。環境因素、遺傳因素、免疫學異常以及氧化應激反應等可能參與多巴胺能神經元的變性死亡過程［8-9］。氧化應激學說認為，正常體內細胞不斷產生自由基，引起脂質過氧化，對蛋白質、DNA均可產生氧化損傷；同時，人體內存在酶性和非酶性兩種抗氧化防御系統來清除這些自由基，保護大腦免受氧化損傷。氧化與抗氧化功能處于動態平衡，如果氧化與抗氧化系統功能平衡失調則導致多巴胺能神經元變性死亡［10］。

3.1 8-OHdG ROS可以直接造成DNA的氧化損傷，8-OHdG是最具有代表性的損傷產物之一［11］。ROS攻擊DNA中的鳥嘌呤的第8位碳原子，使脫氧鳥苷轉換為8-OHdG。由于8-OHdG只通過上述途徑形成，不是細胞更新產物，并且可以在體內穩定存在，在體液中的水平不受飲食等因素影響，因此是可靠的DNA氧化損傷的標志物［11］。ISOBE等［12］采用高效液相色譜法檢測了20例PD患者腦脊液的8-OHdG水平，發現患者的8-OHdG水平顯著高于對照組，并且與疾病病程明顯相關，說明8-OHdG是靈敏可靠的標志物。雖然腦脊液檢查可以直接反映中樞神經系統的內環境，但是不適合隨訪及多次采樣。BOLNER等［13］同樣采用高效液相色譜法檢測受試者的尿8-OHdG水平，發現PD患者明顯高于對照組。CHEN等［14］比較了211例PD患者和135例正常個體的外周血8-OHdG水平，同樣發現PD患者的8-OHdG水平明顯升高，并且中晚期PD患者中8-OHdG水平隨著HY分期的升高而逐漸升高。國內采用8-OHdG作為PD生物標志物的研究仍比較少。本研究結果顯示，PD患者的血漿8-OHdG水平高于對照組，且早期PD患者8-OHdG水平升高更為顯著，這提示PD患者早期階段DNA氧化應激損傷的程度可能更為嚴重，抗氧化應激治療應及早應用。

3.2 MDA ROS攻擊脂質類主要產生MDA、酮基、羥基、羰基、氫過氧基等。MDA是脂質過氧化的降解產物，其水平也可以間接反映細胞損傷的程度。DEXTER等［15］通過尸檢發現PD患者黑質部位的MDA水平要高于患者腦組織其他部位，同時也高于正常個體黑質的MDA水平。這說明MDA可能是一個可靠的反映中樞神經系統脂質氧化損傷的指標。DE FARIAS等［16］對血清中脂質氫過氧化物水平、MDA水平、一氧化氮代謝產物水平、巰基水平、過氧化氫酶活性、超氧化物歧化酶活性、對氧磷酶1活性等幾種氧化應激產物進行檢測分析，發現PD患者的MDA水平較正常個體明顯升高，并且靈敏度和特異度均高于其他幾種標志物。葉心國等［17］對86例PD患者的血漿超氧化物歧化酶、谷胱甘肽及MDA水平進行研究，發現患者的MDA水平明顯高于正常個體。但是，周紅等［18］的研究結果卻未發現相應改變。本研究發現，PD患者的血漿MDA水平較對照組升高，提示這些PD患者的氧化應激損傷可能在疾病發展過程中逐漸增強，有必要注重抗氧化的藥物治療，比如加用較大劑量的輔酶Q10、維生素E等，可能有助于減緩疾病進展。

3.3 DJ-1蛋白 DJ-1蛋白在抗氧化應激方面具有重要作用。發生氧化應激時，DJ-1蛋白的106位半胱氨酸殘基會被氧化修飾，位于胞漿的DJ-1蛋白進入到線粒體內，通過直接清除ROS和調節其他抗氧化酶的活性發揮神經保護作用［19］。目前，對于外周DJ-1蛋白能否作為PD的合適的生物標志物尚存在爭議。WARAGAI等［20］檢測了104例PD患者血漿DJ-1蛋白，發現PD患者明顯高于對照組，并且蛋白水平的升高與疾病的嚴重程度相關。但是，SHI等［21］的研究卻并未發現類似的結果。何丹等［22］對215例PD患者的血清DJ-1蛋白水平進行檢測，并未發現患者與正常對照存在差別，并且DJ-1蛋白水平與疾病嚴重程度無關。本研究也未發現DJ-1蛋白水平在各組中存在顯著差別。究其原因，可能與DJ-1蛋白容易受到外周血污染有關［23］。因此，有些學者嘗試檢測外周血中其他形式的DJ-1蛋白，比如氧化DJ-1蛋白［24］、DJ-1蛋白的同形體［25］，希望能夠更好地反映PD的氧化應激障礙和病情的嚴重程度，但是這些結果仍有待進一步驗證。

綜上所述，PD患者存在過度異常的氧化應激損傷。外周血檢測8-OHdG水平和MDA水平可能作為輔助PD患者診斷并了解病程嚴重程度的生物學預測指標。本研究樣本量有限，仍需進一步擴大樣本量、增加隨訪的時間和增加個體自身指標的比較來進一步驗證。

作者貢獻：趙振華進行文章的構思與設計、數據整理和撰寫論文；魏振和何瑩超進行統計學處理、數據收集；汪效松和汪銀洲進行研究的實施與可行性分析及論文的修訂；程瓊進行文章的構思與設計、質量控制及審校。

本文無利益沖突。