芪杉膠囊對肺癌A549細胞PI3KAKt信號通路影響的研究

隋雨桐，遲文成，姜家康

(黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

肺癌是目前世界范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其中約 80%為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)，肺癌的發生、發展、轉移及復發是由多條信號轉導通路調節、多因素參與的復雜過程。研究證明 PI3K/Akt 信號通路在肺癌的發生、發展中起重要作用，PI3K/Akt 信號通路的激活在肺癌中很常見，被認為是癌細胞存活的重要通路，該信號轉導通路的異常，可導致細胞異常增殖引起腫瘤[1-4]。

本研究所用芪杉膠囊以益氣健脾、養陰潤肺、解毒消癥為法組方，以健脾補中調理氣機為先，兼清熱解毒散結。前期根據多年的隨訪和治療的臨床觀察，發現該復方不僅可以明顯改善患者的機體免疫力，還可以減輕疾病給患者帶來的痛苦，除增加患者的生存率外，在增加患者生存質量，減少腫瘤浸潤與轉移方面也取得了很好的療效。故本研究主要探究芪杉膠囊對肺癌A549細胞PI3KAKt信號通路的影響，以期為臨床治療NSCLC提供可行性實驗依據。

1 實驗材料

1.1 試劑

A549人肺癌細胞株，購自于上海富恒生物科技有限公司；RPMI1640培養基(批號：ABB212917)、PBS緩沖液(批號：AB10100599)，購于Hyclone公司；CellTiter 96?AQueous單溶液細胞增殖檢測試劑盒，購于美國Promega公司(批號：000125538)；Annexin V-PE/7-AAD雙染細胞凋亡檢測試劑盒(批號：CA1120)，購于杭州聯科生物技術股份有限公司；mTOR(批號：2972S)、PI3K(批號：3811S)、AKT(批號：9272S)、Caspase-3(批號：9665S)、Caspase-9(批號：9502S)、Cytochrome c(批號：4272S)一抗，購于美國Cell Signaling Technology公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號：CW0014S)；RIPA加強型裂解液(批號：CW2333S)；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(批號：CW0022S)；蛋白酶抑制劑混合物(批號：CW2200S)；過硫酸銨(APS)(批號：CW0032S)；四甲基乙二胺(TEMED)(批號：CW0034S)；蛋白示蹤上樣緩沖液(批號：CW0052S)；Tris-Glycine SDS電泳緩沖液(批號：CW0045S)；Tris-Glycine轉膜緩沖液(批號：CW0044S)；TBST(批號：CW0043S)；高靈敏度化學發光檢測試劑盒(批號：CW0049M)；Western Blot封閉奶粉(批號：CW2134S)；醋酸纖維素膜(NC膜)，購于美國Pall Life Sciences公司(批號：66485)；超純RNA提取試劑盒(批號：CW0581S)，HiFi-MMLV cDNA Syntheses Kit(批號：CW0744M)，UltraSYBR Mixture(High ROX)(批號：CW2602M)，5x RNA Loading Buffer(批號：CW0611S)，DNase 1(RNase Free)(批號：CW2090S)，購于北京康為世紀生物有限公司。

1.2 儀器

超凈工作臺(上海蘇靜實業有限公司)；CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)；倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；全自動酶標儀(美國Bio-Rad公司)；低溫高速離心機(德國Beckman公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；轉膜設備(美國Bio-Rad公司)；成像系統(美國Bio-Rad公司)；熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；分光光度計(美國Thermo scientific公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 含藥血清的制備

Wistar雄性大鼠隨機分成空白組、芪杉膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組和順鉑組。根據臨床成人用藥劑量的1/2、1和2倍為芪杉膠囊低、中、高劑量，灌胃給藥劑量為8.35 g/kg，16.14 g/kg，36.57 g/kg，連續灌胃3 d，第3天完成灌藥1 h后，乙醚麻醉，無菌條件下腹主動脈取血，將取得的血樣靜置1 h以上，離心2 500 r/min，4℃，10 min后取血清，按組別混合，56℃，30 min滅活，分裝，-2℃冰箱保存。

1.3.2 細胞培養

將凍存的腫瘤細胞株于37℃迅速溶解，將細胞懸液加入到含有血清的培養基中，離心3 000 r/min，3 min。棄去上層培養基，加入含血清培養基，輕輕吹打細胞沉淀后，加入到T25 cm2細胞培養瓶中，至37 ℃細胞培養箱中培養。細胞培養瓶中長至80%～90%時，將培養瓶中細胞培養液倒掉，加入1 mL胰酶消化液潤洗細胞表面。倒掉胰酶，再加入2 mL胰酶，進行消化。消化3 min，加入含血清培養基，輕輕吹打細胞。按1∶3傳代，每3天傳代1次。細胞消化步驟同上，倒掉上層液體，加入細胞凍存液。吹打均勻后，分裝到細胞凍存管中，置于細胞凍存盒中，-80℃冰箱保存。

1.3.3 MTT法檢測含藥血清對A549細胞增殖的影響

將處于對數生長期的A549細胞消化成單細胞懸液，調整細胞濃度至4×104個/mL，接種于96孔細胞培養板中，每孔體積為100 μL。置二氧化碳培養箱中，37℃、5%CO2條件下孵育過夜。次日，棄去孔內培養基。實驗設含藥血清高、中、低劑量組和空白對照組，各劑量組血清含量為20%。血清作用24 h后，小心吸出孔內液體，每孔體積為100 μL不完全培養基，20 μLMTS染色液，培養箱中孵育1 h后，用酶標儀在450 nm處測定各組吸光度值(OD)。按公式計算細胞生長抑制率，細胞生長抑制率(%)=(1-OD受試藥組/OD對照組)×100%。

1.3.4 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測含藥血清對A549細胞凋亡的影響

將A549細胞消化成單細胞懸液，接種于6孔細胞培養板中，每孔體積為1 mL。在CO2培養箱中孵育24 h。實驗設含藥血清高、中、低劑量組和空白對照組血清于藥物作用24 h后。離心收集胰酶消化后單細胞懸液，用預冷的PBS磷酸鹽緩沖液清洗細胞。用1×Binding Buffer緩沖液調節細胞濃度為1×106個/mL。每個樣品管中加入100 μL細胞懸液，約1×105個細胞/每管。每管中加入5 μL AnnexinV-PE染料和10 μL 7-AAD染料，輕輕渦旋混勻后，室溫避光孵育15 min。最后，每管中加入380 μL預冷的1×Binding Buffer緩沖液后，上機檢測細胞凋亡率。

1.3.5 Western-blot法檢測含藥血清對A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響

將A549細胞消化為單細胞懸液，接種于100 mm無菌培養皿中，恒溫培養24 h。高、中、低劑量組和空白對照組血清于藥物作用24 h，離心收集胰酶消化后細胞，加入細胞裂解液，并裂解30 min。低溫離心15 000 r/min，10 min，取上清，即為細胞總蛋白。BCA法蛋白定量，加入緩沖液，高溫煮沸5 min，蛋白變性后，分裝保存。根據蛋白分子量制備分離膠，注入玻璃板內后注入單蒸水隔絕空氣。凝膠40 min后，去掉上層單蒸水后注入2 mL 4%濃縮膠，凝膠30 min后，將玻璃板放入電泳槽中，加入電泳緩沖液后，向各泳道中加入蛋白樣品和蛋白Marker后，80 V恒壓跑濃縮膠，120 V恒壓跑分離膠。蛋白電泳結束后，將切除濃縮膠后的分離膠部分放入轉膜緩沖液中。NC膜和濾紙置轉膜緩沖液中浸泡后將濾紙、NC膜、凝膠、濾紙放入濕轉儀中，200 mA恒流，90 min。將轉完蛋白的NC膜染色，觀察目的蛋白的轉移情況。5%的封閉奶粉或BSA室溫封閉3 min。將NC膜放入封閉奶粉稀釋一抗中，孵育過夜。加入TBST稀釋的二抗，室溫孵育2 h。將ECL發光試劑加到NC膜上后，避光反應，Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.3.6 RT-PCR法檢測含藥血清對A549細胞凋亡相關基因表達的影響

將處于對數生長期的A549細胞消化成單細胞懸液后，調整細胞濃度為1×106個/mL，接種于100 mm無菌培養皿中，每皿5 mL，37℃、5%CO2條件下培養24 h。含藥血清高、中、低劑量組和空白對照組劑量組血清含量為20%，給藥體積為8 mL。藥物作用24 h后，小心棄去皿內液體。預冷PBS刮取細胞后，低溫離心3 000 r/min，2 min，收集細胞。提取細胞樣本中總RNA，取5 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，以檢測RNA的完整性。用DNase Ⅰ試劑盒對RNA中殘留的基因組DNA進行消化處理。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，輕輕吸打混勻，37℃孵育50 min，70℃保溫10 min。反應結束后的cDNA放置-20℃保存。最后采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。

2 結果

2.1 MTT法檢測含藥血清對A549細胞增殖的影響

觀察不同劑量芪杉膠囊含藥血清組和空白組對A549細胞增殖作用的影響，結果表明，高、中、低濃度含藥血清細胞抑制率分別為24.26%，16.44%和10.89%，芪杉膠囊含藥血清濃度越大，對細胞的抑制作用越顯著(見表1)。

表1 芪杉膠囊含藥血清對A549細胞增殖的影響

注：與空白對照組相比，**P<0.01

2.2 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測含藥血清對A549細胞凋亡的影響

觀察不同劑量芪杉膠囊含藥血清組、順鉑組和空白組對A549細胞凋亡的影響，結果表明高、中、低及順鉑組均對細胞凋亡有一定作用，與空白組相比，高、中、低劑量組及順鉑組細胞凋亡率顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.01)，芪杉膠囊含藥血清濃度越大，對細胞凋亡的作用越顯著(見表2，圖1)。

在凋亡圖片中：Annexin V-PE(-)/7-AAD(-)為活細胞；Annexin V-PE(+)/7-AAD(-)為早期凋亡細胞；Annexin V-PE(+)/7-AAD(+)為晚期凋亡細胞；Annexin V-PE(-)/7-AAD(+)為壞死細胞。

表2 芪杉膠囊含藥血清對A549細胞凋亡的影響

注：與空白對照組相比，**P<0.01

圖1 Annexin V-PE/7-AAD雙染法檢測含藥血清對A549細胞凋亡

2.3 Western-blot法檢測含藥血清對A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響

觀察不同劑量芪杉膠囊含藥血清組、順鉑組及空白組A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響。結果表明芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組Caspase-3的相對表達量與空白組相比，表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中劑量組及順鉑組Caspase-9的相對表達量與空白組相比，表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組Cytochrome c的相對表達量與空白組相比，表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組AKT的相對表達量與空白組相比，表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01，P<0.05)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組mTOR的相對表達量與空白組相比，表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中劑量組及順鉑組PI3K的相對表達量與空白組相比，表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。芪杉膠囊含藥血清濃度越大，對A549細胞凋亡相關Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c、AKT、mTOR及PI3K蛋白表達的影響越顯著(見表3、4，圖2)。

表3 芪杉膠囊含藥血清對A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響

注：與空白對照組相比，**P<0.01

表4 芪杉膠囊含藥血清對A549細胞凋亡相關蛋白表達的影響

注：與空白對照組相比，**P<0.01，*P<0.05

圖2 Western-blot法檢測含藥血清對A549細胞凋亡相關蛋白表達

2.4 RT-PCR法檢測含藥血清對A549細胞凋亡相關基因表達的影響

觀察不同劑量芪杉膠囊含藥血清組、順鉑組及空白組A549細胞凋亡相關基因表達的影響。結果表明芪杉膠囊含藥血清高、中劑量組及順鉑組Caspase-3的相對表達量與空白組相比，表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組Caspase-9的相對表達量與空白組相比，表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組Cytochrome c的相對表達量與空白組相比，表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組AKT的相對表達量與空白組相比，表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組mTOR的相對表達量與空白組相比，表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組PI3K的相對表達量與空白組相比，表達量顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.01)。芪杉膠囊含藥血清濃度越大，對A549細胞凋亡相關Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c、AKT、mTOR及PI3K基因表達的影響越顯著(見表5、6)。

表5 含藥血清對A549細胞凋亡相關基因表達的影響

注：與空白對照組相比，**P<0.01

表6 含藥血清對A549細胞凋亡相關基因表達的影響

注：與空白對照組相比，**P<0.01

3 討論

PI3K/Akt通路被認為是癌細胞存活的首要通路，有“抗凋亡途徑”之稱。該信號轉導通路的異常，可導致細胞異常增殖引起腫瘤。另外，mTOR是PI3K/Akt的下游靶點，PI3K/Akt信號通路通過磷酸化激活mTOR，調控相關mRNA的轉錄，調節蛋白的合成，進而影響細胞增殖，從而使腫瘤細胞達到耐藥[5]?；赑I3K/Akt信號通路與NSCLC的發病及預后關系密切，針對此信號通路抑制劑的研究也在不斷進行。目前，有些PI3K/Akt信號通路抑制劑已經合成，但是這些抑制劑大多毒性劇烈，患者很難耐受，現只能用作生物學研究[6-9]。因此，針對多靶點同時抑制，并且具有低毒性的藥物是我們研究尋求的方向。中醫藥以其穩定的療效、低毒副反應、多向調節的特點成為我們探究肺癌的治療方法方向提供了思路。

本研究中，芪杉膠囊中紅豆杉、半枝蓮、白花蛇舌草等藥均有抗癌的物質基礎，且多味中藥同時調節免疫功能。一方面提示該方確有抗腫瘤研究價值，另一方面，該方具有增強機體免疫力，控制癌細胞擴散，改善癥狀的作用。正常細胞都具有增殖、分化和凋亡三種特性，一般情況下，三者相互協調，保持平衡，在細胞衰老與更新、保持細胞數目的相對恒定中起著重要作用。細胞凋亡進程受到抑制，細胞的增殖與凋亡失去平衡，導致細胞死亡率下降，則細胞數目不斷增加，就會表現出生長優勢，這是腫瘤形成的一個重要病理生理基礎[10-11]。本實驗用不同濃度芪杉膠囊含藥血清作用于肺癌A549細胞，均表現為抑制癌細胞增殖的作用，且含藥血清濃度越大，對細胞的抑制作用越顯著。細胞凋亡本質上是程序性細胞死亡，是由于體內、外環境變化或死亡信號觸發，啟動自身內部機制，經過多途徑的信號傳遞，導致細胞生命結束[12]。細胞凋亡的異常減少參與腫瘤的發生發展，因此，誘導腫瘤細胞凋亡的策略始終為近年來腫瘤治療研究的熱點和重點。本實驗以不同濃度芪杉膠囊的含藥血清作用肺癌A549細胞，均對細胞凋亡有一定作用，與空白組相比，芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組細胞凋亡率顯著升高，且芪杉膠囊含藥血清濃度越大，對細胞凋亡的作用越顯著。分別檢測不同劑量芪杉膠囊含藥血清組、順鉑組及空白組A549細胞凋亡相關Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c、AKT、mTOR及PI3K蛋白和基因表達的影響。結果顯示,芪杉膠囊含藥血清高、中、低劑量組及順鉑組蛋白和基因相對表達量與空白組相比，表達量降低；且芪杉膠囊含藥血清濃度越大，對A549細胞凋亡相關蛋白和基因表達的影響越顯著。

綜上所述，芪杉膠囊具有抑制腫瘤的作用，可能通過A549細胞凋亡相關Caspase-3、Caspase-9、Cytochrome c、AKT、mTOR及PI3K蛋白和基因表達，抑制細胞增值、促進細胞凋亡等途徑實現。