芪連扶正膠囊編輯肺癌干細(xì)胞免疫重塑的研究

李慧杰，齊元富，李秀榮，張盈盈

(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中存在的一小部分具有自我更新能力和分化潛能的細(xì)胞，亦是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移過程中存在免疫逃逸現(xiàn)象，而免疫重塑是最終導(dǎo)致逃逸的關(guān)鍵[2]。中醫(yī)藥防治腫瘤在改善機(jī)體免疫功能、提高患者生活質(zhì)量方面彰顯優(yōu)勢，基于此，筆者觀察了芪連扶正膠囊對肺癌干細(xì)胞(Lung cancer stem cell, LCSC)免疫相關(guān)因子白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead/winged helix transcription factor，F(xiàn)oxp3)表達(dá)的影響，意在探討其調(diào)節(jié)肺癌干細(xì)胞免疫重塑情況，以期為抑制肺癌轉(zhuǎn)移及肺癌治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞與動物

細(xì)胞為山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室惠贈的人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞株。實驗動物為濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司SPF級體質(zhì)量(200±10)g、雄性SD大鼠(質(zhì)量合格證號SCXK(魯)20140007)。

1.2 主要試劑藥品

芪連扶正膠囊(山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院Z01080226);注射用順鉑(齊魯制藥有限公司H20023461);RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(天津市灝洋生物制品科技有限公司);CD133細(xì)胞分離試劑盒、PE標(biāo)記的CD133抗體(美國Gene Copoeia公司);Elisa檢測試劑盒(南京巴傲得生物科技有限公司);BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、Foxp3一抗、β-actin一抗、標(biāo)記二抗(北京百奧萊博科技有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司);引物(生工生物工程股份有限公司)。

1.3 儀器

德國BB5060UV型CO2培養(yǎng)箱;美國Thermo Forma超凈工作臺及全波長酶標(biāo)儀;日本Olympus倒置相差顯微鏡;美國Becton Dickinson流式細(xì)胞儀;美國Bio-Rad Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)膜儀;美國Bio-rad電泳系統(tǒng);美國Alpha Innotech Fluor Chem Q成像分析系統(tǒng);美國Therm Fisher PCR儀;ROCHE實時熒光定量PCR儀。

1.4 芪連扶正膠囊含藥血清制備

購買體質(zhì)量(200±10)g的雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5天；隨機(jī)分為芪連扶正膠囊組及對照組，芪連扶正膠囊組大鼠灌胃應(yīng)用芪連扶正膠囊溶液，對照組應(yīng)用等量生理鹽水，每日灌胃1次、連續(xù)灌14 d；末次灌胃前12 h禁食，末次灌胃后1 h10%水合氯醛麻醉大鼠；經(jīng)腹主動脈取血，離心取血清，0.22 μm微孔濾膜過濾，保存于-80℃冰箱備用。

1.5 免疫磁珠法分選肺癌干細(xì)胞

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，消化收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度,清洗、加入緩沖液重懸細(xì)胞，按CD133細(xì)胞分離試劑盒說明逐步進(jìn)行，流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞的百分率，分選的CD133+陽性比例為80.79%，可用于后續(xù)實驗。

1.6 Elisa法檢測IL-10、TGF-β1

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，按實驗分組干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心收集，保存于-80℃冰箱備用；檢測時，配制標(biāo)準(zhǔn)品，加樣，封板溫育30 min，洗板，加酶標(biāo)試劑，重復(fù)后加顯色劑，震蕩混勻，避光顯色15 min，加終止液，酶標(biāo)儀450 nm波長下測定各孔吸光度值(OD值)，計算數(shù)據(jù)。

1.7 Western blot檢測Foxp3

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，按實驗分組干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取蛋白，BCA試劑盒蛋白定量。組裝固定玻璃板，分別灌分離膠、濃縮膠，插入梳子，待濃縮膠完全聚合后放入電泳槽內(nèi)固定，加電泳緩沖液，拔出梳子，加樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色，5%脫脂奶粉封閉，一抗4℃過夜，二抗恒溫?fù)u床1 h，ECL曝光成像，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.8 RT-PCR法檢測TGF-β1mRNA

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，按實驗分組加藥，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，逐步提取總RNA，測定RNA濃度，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)進(jìn)行后續(xù)實驗；其中引物序列為TGF-β1上游5＇-GTACCTGAACCCGTGTTGCT -3＇、下游5＇-GTATCGCAGGAATTGTTGC -3＇；GAPDH上游5＇-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG -3＇、下游5＇-AGGGGCCATCCACAGTCTTC -3＇；根據(jù)說明書逐步合成cDNA，PCR擴(kuò)增，上機(jī)檢測，根據(jù)公式2-△△CT處理實驗數(shù)據(jù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

運用IBM SPSS19.0軟件，數(shù)據(jù)處理采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Elisa檢測肺癌干細(xì)胞IL-10、TGF-β1表達(dá)情況

經(jīng)單因素方差分析，與對照組相比，各藥組均可降低細(xì)胞IL-10和TGF-β1的表達(dá)(P<0.05或P<0.01)；與DDP組相比，芪連扶正膠囊組及聯(lián)合組的IL-10和TGF-β1表達(dá)情況均與之差異顯著(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.2 Western blot檢測肺癌干細(xì)胞Foxp3表達(dá)情況

對照組、芪連扶正膠囊組、順鉑組、聯(lián)合組的肺癌干細(xì)胞Foxp3表達(dá)量分別為：(54.36±3.59)%，(41.20±4.03)%，(35.28±4.12)%，(26.51±3.96)%；經(jīng)單因素方差分析，與對照組相比，各藥組均可降低Foxp3表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，兩藥聯(lián)合效果最佳,見圖1。

表1 Elisa檢測肺癌干細(xì)胞IL-10、TGF-β1表達(dá)情況

注：與對照組比較，▲P<0.05,▲▲P<0.01;與順鉑組比較，*P<0.05,**P<0.01

圖1 Foxp3 Western blot圖(注：圖片從左到右依次為對照組、芪連扶正膠囊組、順鉑組、聯(lián)合組)

2.3 RT-PCR檢測肺癌干細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)情況

對照組、芪連扶正膠囊組、順鉑組、聯(lián)合組的肺癌干細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)量分別為：(1.27±0.26)%，(1.01±0.20)%，(0.77±0.14)%，(0.50±0.10)%；經(jīng)單因素方差分析，與對照組相比，各藥組均可降低TGF-β1mRNA表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，其中芪連扶正膠囊聯(lián)合順鉑組差異最顯著,見圖2。

圖2 TGF-β1mRNA PCR圖

3 討論

早在1980年LCSC就被證實存在于肺癌組織中，它是來源于肺癌的一部分細(xì)胞群，具有自我更新、增殖分化、強(qiáng)致瘤性、且可被特異性標(biāo)記物標(biāo)記[3]?；谀[瘤干細(xì)胞理論，多項研究結(jié)果證實了LCSC與肺癌發(fā)生、侵襲、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是肺癌轉(zhuǎn)移的根源和潛在的治療靶點。LCSC因自我更新特性在肺癌發(fā)生時已占據(jù)優(yōu)勢，并不斷增殖促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長，待生長到一定程度時，因增殖的肺癌細(xì)胞需要更多營養(yǎng)物質(zhì)，LCSC便利用其多向分化能力轉(zhuǎn)分化為內(nèi)皮細(xì)胞樣細(xì)胞，構(gòu)建組織中的腫瘤血管形成，加速腫瘤生長；一旦腫瘤被發(fā)現(xiàn)并經(jīng)手術(shù)、放化療等治療后，肺癌細(xì)胞被大部分殺傷，但LCSC卻可幸免，并在外干預(yù)停止后復(fù)燃肺癌細(xì)胞，導(dǎo)致肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[4-5]。

機(jī)體免疫系統(tǒng)具有抗腫瘤的保護(hù)功能，以及對腫瘤的重新塑型功能，我們將后者稱之“免疫重塑”，即免疫系統(tǒng)不斷殺傷較高免疫原性的腫瘤細(xì)胞，同時忽略低免疫原性的腫瘤細(xì)胞，逐漸出現(xiàn)免疫原性更低、惡性程度更高的腫瘤表型，并在體內(nèi)存留下來的過程[6]。免疫重塑不但可以影響機(jī)體免疫系統(tǒng)對腫瘤進(jìn)行重塑與編輯，亦可改變機(jī)體免疫系統(tǒng)相關(guān)成分，從而更利于腫瘤免疫逃逸的形成，腫瘤發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移。免疫重塑的腫瘤細(xì)胞能產(chǎn)生大量抑制性細(xì)胞因子，如IL-10、TGF-β等，其通過直接接觸及誘導(dǎo)該類因子削弱CTL細(xì)胞、NK細(xì)胞的殺傷活性，進(jìn)而逃逸機(jī)體免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[7-8]。其中，IL-10是參與腫瘤免疫逃逸的重要免疫抑制因子，具有雙向免疫調(diào)節(jié)特性，其介導(dǎo)免疫抑制機(jī)制是通過作用于不同免疫細(xì)胞亞群多途徑發(fā)揮免疫抑制，促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫逃逸[9]。TGF-β可直接或間接作用于免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)其功能缺失，幫助腫瘤逃避機(jī)體免疫監(jiān)視功能，促進(jìn)腫瘤發(fā)展；另外，TGF-β可促進(jìn)腫瘤組織血管生成、加速腫瘤細(xì)胞和外基質(zhì)之間相互作用，抑制機(jī)體免疫，利于腫瘤生長及加速其浸潤轉(zhuǎn)移[10-11]。而Foxp3是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞最特異的生物學(xué)標(biāo)記，在部分腫瘤中使腫瘤細(xì)胞具有了類Treg功能，該功能可抑制機(jī)體產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，終致腫瘤免疫逃逸、腫瘤進(jìn)展，且有研究發(fā)現(xiàn)肺癌中Foxp3表達(dá)與TGF-β1、IL-35等免疫抑制因子的表達(dá)呈正相關(guān)，提示FOXP3參與肺癌免疫逃逸，抑制機(jī)體抗腫瘤功能，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[12-13]。

芪連扶正膠囊由黃芪、連翹等11味藥物組成，是山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)的具有解毒化痰、消積散結(jié)、扶正抗癌之效的抗腫瘤中成藥，已廣泛應(yīng)用于臨床多年。前期我們進(jìn)行了相關(guān)研究，臨床研究觀察了芪連扶正膠囊對化療患者免疫功能的影響，結(jié)果顯示：芪連扶正膠囊組促進(jìn)白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞至正常水平，有效率高達(dá)94.29%，T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞活性亦較對照組改善明顯，可保護(hù)機(jī)體免疫功能[14]；芪連扶正膠囊聯(lián)合化療治療晚期非小細(xì)胞肺癌，可改善患者大部分臨床癥狀，提高其生活質(zhì)量，不僅能保護(hù)機(jī)體免疫功能，還可減輕化療毒副作用，且維持治療能延長晚期非小細(xì)胞肺癌患者無疾病進(jìn)展生存期[15]。實驗研究發(fā)現(xiàn)芪連扶正膠囊可使荷瘤小鼠的免疫器官重量增加，可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，增強(qiáng)荷瘤小鼠的NK細(xì)胞活性；且芪連扶正膠囊可通過調(diào)控TGF-β通路抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖侵襲，進(jìn)而延緩腫瘤發(fā)展[16-17]。前期研究從不同角度證實芪連扶正膠囊具有提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移作用，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究觀察了芪連扶正膠囊含藥血清對肺癌干細(xì)胞免疫相關(guān)因子IL-10、TGF-β1、Foxp3表達(dá)的影響，結(jié)果顯示芪連扶正膠囊可明顯降低IL-10、TGF-β1表達(dá)，下調(diào)FOXP3及TGF-β1mRNA表達(dá)，改善肺癌干細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)。

綜上可知，肺癌干細(xì)胞是肺癌轉(zhuǎn)移的根源，免疫重塑加速肺癌轉(zhuǎn)移，IL-10、TGF-β、FOXP3等免疫相關(guān)因子在免疫重塑過程中發(fā)揮重要作用，而芪連扶正膠囊可通過降低IL-10、TGF-β1、Foxp3表達(dá)水平改善細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫重塑、抑制肺癌轉(zhuǎn)移的作用?；诖?，進(jìn)一步探尋中醫(yī)藥免疫治療靶點可為抑制肺癌轉(zhuǎn)移及肺癌綜合治療提供新策略。