西洋參與花旗澤仁在大鼠血漿中人參皂苷Rb1的藥代動力學比較研究

劉凱新，韓東衛，朱蕾，葛鵬玲

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

目前糖尿病(Diabetes mellitus，DM)已經成為嚴重危害我國人民健康的重要慢性非傳染性疾病之一[1]。糖尿病是由于胰島素分泌絕對或相對不足(胰島素分泌缺陷)，及機體靶組織或靶器官對胰島素敏感性的降低，導致的以血糖水平升高，或伴有以血脂異常等特征的代謝性疾病[2]。主要為4種類型，1型、2型、妊娠糖尿病與其他類型糖尿病，其中大于90%患者是2型糖尿病。花旗澤仁由西洋參、薏苡仁和澤瀉等中藥組成，是臨床治療2型糖尿病胰島素抵抗的經驗方。臨床療效證實，花旗澤仁治療脾虛濕盛，濕熱內蘊型糖尿病胰島素抵抗及相關疾病效果顯著[3]。為完善花旗澤仁成藥性評價，本研究選擇西洋參活性部位中含量較高，且藥理活性已被證實的化學成分20(R)人參皂苷Rb1，作為藥代動力學檢測的指標性成分。

人參皂苷Rb1為西洋參的主要有效成分之一，Yang等[4]研究發現人參皂苷Rb1能夠改善血糖水平。Vladimir Vuksan等[5]研究發現西洋參能夠降低餐后血糖，并改善糖尿病代謝水平。Xie等[6]從西洋參果中分離提取多糖部分，發現西洋參中多糖成分具有降血糖作用。實驗表明西洋參具有降血脂的藥理作用[7]。以上均為西洋參對2型糖尿病的預防治療提供重要的參考意義。本文研究配伍前后西洋參中活性成分人參皂苷Rb1在大鼠血漿中的比較藥代動力學特征，完善花旗澤仁成藥性評價。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

液相色譜/四級桿-飛行時間串聯液質聯用儀，美國Agilent公司；VORTEX-GENIE 2渦旋混合儀，美國Scientific公司；Centrifuge 5417R低溫高速冷凍離心機，德國Eppendorf AG公司；SB-100 DT超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Sartorius BSA224S-CW電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；氮吹儀，上海允延儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑

西洋參、澤瀉、薏苡仁購買于黑龍江省世一堂中藥飲片廠；人參皂苷Rb1標準品，成都MUST生物技術有限公司；地西泮標準品，中國藥品生物鑒定所；甲醇(色譜純)，重慶迪馬工業有限責任公司；乙腈(色譜純)，重慶迪馬工業有限責任公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；正己烷，天津市福晨化學試劑廠；氫氧化鈉，天津市福晨化學試劑廠；肝素鈉，北京索萊寶科技有限公司；氮氣，哈爾濱春霖氣體有限公司。實驗所用其他試劑均為色譜級別。

1.3 實驗動物

黑龍江中醫藥大學實驗動物中心提供，清潔級Sprague-Dawley(SD)大鼠12只，雄性，3月齡，體質量(200±20)g，動物合格證號：SCXK(黑)2013-004。

1.4 制備花旗澤仁水煎液

取花旗澤仁、西洋參浸泡12 h，分別煎煮，合并3次水煎液，過濾后花旗澤仁組水浴濃縮至每毫升含0.54 g生藥藥液，西洋參水浴濃縮至每毫升含0.135生藥藥液。4℃保存。

1.5 色譜與質譜條件

1.5.1 色譜條件

液相色譜：色譜柱為C18柱(1.8 μm，100 mm×3.0 mm，Agilent Technologies，美國)，流動相：A相為水(含0.1%甲酸)，B相為乙腈。流速0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣溫度4 ℃；進樣體積為10 μL。在流動相中加入0.1%甲酸以改善色譜峰形。梯度洗脫方式，樣品的分析周期為12 min。洗脫程序見表1。

1.5.2 質譜條件

采用液相色譜/四級桿-飛行時間串聯液質聯用儀，液相色譜接口為電噴霧離子化離子源，負離子檢測模式。離子源電壓3 500 V、霧化器流速10 L/min、霧化器溫度350 ℃、干燥氣溫度350 ℃、干燥氣流速10 L/min、掃描頻率2 amu/s、掃描范圍100～1 300 amu、霧化器壓力50 V、毛細管電壓3 500 V。人參皂苷Rb1的質譜參數為1 107.596 0。

表1 流動相洗脫程序

1.6 血漿樣品處理方法

移取100 μL血漿樣品，準確加入500 μL含內標(地西泮為0.1 μg/mL)的甲醇溶液進行蛋白沉淀法(Protein Precipitation，PP)處理，2 min渦旋，10 min高速離心4℃12 000 rpm，取上清液于30℃氮氣流下吹干，100 μL甲醇加入殘渣，渦旋使復溶，12 000 rpm高速離心10 min，取上清液進行HPLC-MS/MS分析，進樣體積為10 μL。

1.7 標準曲線血漿樣品與質控(quality control, QC)樣品的配制

儲備液配制：精密稱取5 mg地西泮(Diazepam)，溶劑為甲醇，制濃度為200 μg/mL的內標儲備液。人參皂苷Rb14 mg，溶劑為甲醇，制濃度為400 μg/mL的儲備液。-20℃保存儲備液。

工作液配制：精密移取儲備液，以甲醇為溶劑制備人參皂苷Rb1一系列混合工作液為：1、2、4、10、20、40、100、200 μg/mL。

將配置好的一系列混合工作溶液，以空白血漿作為溶劑進行1:20比例稀釋，得到標準曲線血漿樣品，人參皂苷Rb1濃度范圍為0.05～10 μg/mL。

QC樣品同法稀釋配制，配制人參皂苷Rb1濃度為0.1、1、8 μg/mL。

1.8 人參皂苷Rb1在大鼠血漿中的比較藥代動力學實驗

取SD大鼠12只，雌性，隨機分為2組，分別給予花旗澤仁、西洋參水煎液，劑量為1 mL/100 g體質量。花旗澤仁組于給藥前及給藥后0.25、0.5、0.75，1、2、3、4、6、8、12、24、48 h由眼眶靜脈叢取血約0.5 mL。西洋參組給藥前及給藥后0、0.25、0.5、0.75，1、2、3、4、6、8、12、24、48 h由眼眶靜脈叢取血約0.5 mL。均肝素抗凝，離心4 000 rpm，時間為5 min，取血漿，按照1.6項下操作處理血漿樣品。

1.9 藥代動力學數據處理

利用DAS2.0數據處理軟件的非房室模型法(統計矩法)計算藥代動力學參數，包括：峰值濃度(Cmax)、濃度達峰時間(Tmax)、消除半衰期(t1/2)、藥-時曲線下面積(AUC)、平均駐留時間(MRT)、血漿清除率(CL)等。

統計學差異采用軟件SPSS19.0進行分析。

2 結果

2.1 方法學驗證

2.1.1 選擇性

人參皂苷Rb1和內標采用負離子模式對待測成分進行監測。待測組分的MS/MS產物離子圖譜見圖1。地西泮為人參皂苷Rb1的內標。分別對內標物、人參皂苷Rb1血漿樣品、空白血漿樣品添加的待測組分和內標物進行液質掃描，如圖2可觀察到空白血漿中的其他內源性成分對測定物不造成干擾，圖2顯示，人參皂苷Rb1保留時間為6.18 min，內標物地西泮的保留為1. 67 min。

圖1 人參皂苷Rb1產物離子

圖2 地西泮(1)人參皂苷Rb1(2)的血漿樣品色譜圖：空白血漿(A)；空白血漿添加的待測組分和內標(B)；給藥2 h后的實測血漿樣品(C)

2.1.2 標準曲線和定量下限(Lower limit of quantification，LLOQ)

以標準血漿樣品濃度為橫坐標X，以人參皂苷Rb1峰面積與內標物地西泮峰面積作比為縱坐標Y，分別采用1/X加權最小二乘法進行線性回歸，制作標準曲線，計算線性回歸方程為Y=3.346 8X-0.052 8，R2=0.998 5。最低定量下限(S/N=1∶10)為0.05 μg/mL。

2.1.3 精密度和準確度

將配制好的QC樣品分別按照血漿樣品處理方法進樣分析，于日內進行6次測定，得到待測組分及內標峰面積值，分別帶入回歸方程計算濃度值，求算日內精密度與準確度。于日間進行6次測定,求算日間精密度和準確度。

表2 待測組分在大鼠血漿中的精密度和準確度

精密度表示為相對標準偏差(RSD)應≤20%，準確度表示為相對偏差(RE)應在±20%范圍內。如表4所示，人參皂苷Rb1日內與日間精密度(RSD)分別為6.3%～8.7%與5.2%～9.0%，日內與日間準確度(RE)分別為2.4%～6.7%與-1.5%～3.2%。根據數據表明待測組分在大鼠血漿中的精密度和準確度均符合分析要求。

2.1.4 基質效應和提取回收率

將配制好的QC樣品按照血漿樣品處理方法進樣分析，測得待測成分與內標峰面積A3。將2組不同個體的空白血漿樣品(n=6)分別按照血漿樣品處理方法操作后，分別加入與QC樣品同等濃度的人參皂苷Rb1與內標混合標準溶液，進樣分析測得峰面積A2。將上述混合標準溶液進樣分析，得到峰面積A1。

絕對基質效應為A2/ A1；提取回收率為A3/A2。

表3列出了人參皂苷Rb1與內標的基質效應和提取回收率結果。由此表可知在三個濃度下，活性成分均存在一定的基質效應，均在85%～115%范圍內，且精密度RSD均小于20%，符合生物樣品分析要求。提取回收率結果顯示在血漿樣品前處理條件下，蛋白沉淀法對人參皂苷Rb1的提取回收率均大于80%。可見人參皂苷Rb1采用血漿處理方法提取回收率良好。

表3 待測組分在大鼠血漿中的基質效應和提取回收率(n=6)

2.1.5 樣品穩定性

配制好的QC樣品分別做如下處理：①反復動融3次后按照血漿樣品處理方法后進樣分析；②室溫下25℃放置4 h后按照血漿樣品處理方法操作進樣分析；③置于-80℃冷凍2周后取出解凍后按照血漿樣品處理方法操作進樣分析；④按照血漿樣品處理方法操作后置于自動進樣器(4℃)12 h后進樣分析。將上述測得峰面積值帶入回歸方程求算血藥濃度。

表4 待測組分在大鼠血漿中的穩定性

見表4，三個QC濃度的標準血漿樣品的3次凍融循環后的穩定性結果相對標準偏差RSD為7.3%～14.9%，相對偏差RE為-5.2%～4.1%；室溫下25℃放置4h的短期穩定性考察結果相對標準偏差RSD為7.5%～12.6%，相對偏差RE為-3.2%～3.8%；-80℃冷凍條件下保存2周的穩定性結果相對標準偏差RSD為5.9%～10.1%，相對偏差RE為-2.4%～3.1%；以及樣品處理后置于自動機進樣器(4℃)中12h的穩定性結果相對標準偏差RSD為9.7%～10.6%，相對偏差RE為-3.5%～3.0%，RSD結果均小于20%，RE均在±20%范圍內，表明待測組分在大鼠血漿中的穩定性符合生物樣品的分析要求。

2.2 花旗澤仁組、西洋參組中主要有效成分比較藥代動力學

表5 大鼠口服不同水煎液后人參皂苷Rb1的血藥濃度-時間數據(ng/mL)

注:n.d.未檢測到，低于LLOQ.

表6 大鼠口服不同水煎液后人參皂苷Rb1的主要藥代動力學參數

注:與西洋參組比較，*P<0.05,**P<0.01

圖3 大鼠口服不同提取物后人參皂苷Rb1的平均血藥濃度-時間曲線

3 討論

本實驗利用已建立的LC-MS/MS檢測大鼠血漿中指標成分的方法，測定正常大鼠分別灌胃花旗澤仁、西洋參后不同時間點指標成分在大鼠血漿樣品中的濃度，利用DAS2.0藥代動力學軟件，進行血藥濃度分析。實驗結果表明配伍后在大鼠體內吸收良好，體內存留量適宜。從MRT和t1/2值可以看出，配伍后活性成分人參皂苷Rb1在體內消除較慢。在一定時間可以維持穩定的藥物治療濃度。西洋參組中人參皂苷Rb1藥代動力學參數結果表明與花旗澤仁組中人參皂苷Rb1在大鼠體內代謝過程基本類似，根據數據可顯示其吸收較好，在體內的存留量適宜，體內消除較慢，在一定的時間內也可維持穩定的藥物治療濃度。

與西洋參組相比，花旗澤仁組人參皂苷Rb1的主要藥動學參數有顯著性的變化，其中Cmax增大，藥時曲線下面積AUC0-t增加，半衰期t1/2與平均駐留時間MRT0-t明顯延長，清除率CL顯著降低，此外血藥濃度達峰時間延長，說明組方配伍可延長人參皂苷Rb1在體內的吸收時間，提高人參皂苷Rb1的血藥濃度，增加其在體內的吸收程度，并減慢其代謝速度，增加其在體內的駐留時間，復方配伍后起到了延長人參皂苷Rb1

在體內作用時間的作用(見表6)。更有利于人參皂苷Rb1發揮降血糖、改善胰島素抵抗等藥理作用。

人參皂苷Rb1在大鼠體內的吸收增加，經查閱文獻報道[8]，人參皂苷Rb1的吸收過程屬于被動擴散，人參皂昔Rbl是藥物轉運蛋白P-gp底物，受到P-gp外泵作用，致使人參皂苷Rb1在大鼠體內的生物利用度較低。配伍后Cmax與AUC0-t明顯升高，提高了人參皂苷Rb1在大鼠的體內血藥濃度，可能是由于花旗澤仁配伍后某種成分抑制了P-gp轉運蛋白，或與P-gp存在競爭結合作用，導致人參皂苷Rb1受P-gp蛋白的外排作用減弱，進而改變了人參皂苷Rb1在正常大鼠體內的吸收行為。

對于花旗澤仁治療2型糖尿病而言，活性成分在胰島素抵抗發生相關組織中的分布水平可能顯得更為重要。我們將繼續進行探索。