全國中藥資源普查采集女貞子樣品農(nóng)藥殘留研究

高巖,劉薇,熊慧，薛雪，劉夢楠，李向日*,魏鋒*

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488;2.中國食品藥品檢定研究院中藥民族藥檢定所，北京 100050)

我國80%中藥材來源于人工栽培[1]，為了防治病蟲害，栽培過程中不可避免需要使用農(nóng)藥，但其中部分藥材在栽培過程中不合理使用農(nóng)藥，造成農(nóng)藥殘留超標，給中藥臨床應用的安全性造成了巨大的隱患，同時也制約了中藥及相關產(chǎn)品的發(fā)展和推廣。

女貞子為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit. 的干燥成熟果實,具有滋補肝腎，明目烏發(fā)的功效[2]。其主要活性成分為萜類和苯乙醇苷類等有機類成分[3]與相關無機元素。其效果確切，臨床應用范圍廣，是多種中成藥和保健食品的原料藥。2013年第四次全國中藥資源普查項目發(fā)現(xiàn)女貞子分布區(qū)域廣、產(chǎn)地多，各產(chǎn)地自然氣候條件和采收加工差異等因素導致其質量參差不齊，質量控制和安全評價標準亟待進一步規(guī)范。對其質量控制研究較多，但對于女貞子農(nóng)藥殘留相關研究較少[4]。因此，本實驗建立氣相色譜-串聯(lián)質譜法和液相色譜-串聯(lián)質譜法農(nóng)殘測定方法，測定全國第四次中藥資源普查所收集的不同產(chǎn)地的48批女貞子樣品中的229種農(nóng)藥殘留并根據(jù)《中國藥典》[2]女貞子項下含量測定的規(guī)定對其進行含量測定，為了解全國范圍內(nèi)女貞子農(nóng)藥殘留現(xiàn)狀及進一步指導女貞子栽培中農(nóng)藥的合理使用提供數(shù)據(jù)支撐和科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

超高液相色譜串聯(lián)四級桿質譜儀(Waters，ACQUITY UPLC-Vex TQ-S MS)、十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(1.6 μm，2.1 mm×150 mm， CORTECSTM UPLC C18)、氣質聯(lián)用儀(Agilent 7890B/5977A GC/MSD)、彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,DB17ms)、Sartorius電子分析天平(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 試劑

禾草敵、環(huán)草丹、草達滅(編號：GBW(E)082601，濃度為100 μg·mL-1，北京壇墨質檢科技有限公司);異丙甲草胺(編號：GBW(E)082612，濃度為100 μg·mL-1，天津農(nóng)業(yè)部);毒死蜱(編號：BW900808-100-N，濃度為100 μg·mL-1，北京壇墨質檢科技有限公司);三唑磷(編號：GBW(E)082340，濃度為100 μg·mL-1，北京壇墨質檢科技有限公司);三氟氯氰菊酯(編號：GSB05-2305-2016，濃度為100 μg·mL-1，天津農(nóng)業(yè)部)乙腈(色譜級，美國Fisher公司);甲酸、甲酸銨樣品共批來源于第四次資源普查采集的女貞子48批藥材，經(jīng)鑒定為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit的干燥成熟果實，其中安徽7批、四川3批、云南5批、湖南13批、山西8批、河南12批，樣品信息見表1。

2 實驗方法

應用氣相色譜-串聯(lián)質譜法和液相色譜-串聯(lián)質譜法[5]測定229種農(nóng)藥種類，其中采用氣相色譜-串聯(lián)質譜法測定144種，液相色譜-串聯(lián)質譜法測定85種。

表1 樣品信息

2.1 對照品貯備液的制備

分別精密移取各農(nóng)藥對照品貯備溶液適量，以丙酮為溶劑于100 mL棕色容量瓶中定容，混勻，作為混合對照品貯備溶液。

2.2 混合對照品工作溶液的制備

分別精密量取混合貯備液適量，加乙腈制成含各對照品為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng·mL-1不同濃度系列的混合對照品溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.3 內(nèi)標貯備溶液的配制

精密量取磷酸三苯酯溶液(100 μg·mL-1)5 mL，置500 mL棕色容量瓶中，以乙腈為溶劑定容至刻度，混勻，即得。

2.4 氣相色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS/MS)分析用內(nèi)標-分析保護劑的配制

精密稱取核糖酸內(nèi)酯1.0 g，置50 mL棕色容量瓶中，以乙腈為溶劑溶解，定容至刻度(A液，20 mg·mL-1)；另精密稱取山梨醇0.50 g，置50 mL棕色容量瓶中，以乙腈：水(1:1)為溶劑溶解，定容至刻度(B液，10 mg·mL-1)。混合上述 A、B溶液，搖勻，精密加入上述內(nèi)標貯備溶液5 mL，搖勻，即得(含磷酸三苯酯約50 ng·mL-1)。

2.5 液相色譜-串聯(lián)質譜法 (LC-MS/MS)分析用內(nèi)標溶液的配制

精密量取上述內(nèi)標貯備溶液5 mL，置100 mL棕色容量瓶中，以乙腈為溶劑定容至刻度，混勻，即得(含磷酸三苯酯約50 ng·mL-1)。

2.6 色譜分析條件

2.6.1 GC-MS/MS分析條件

色譜柱：彈性石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,DB17ms)；載氣：高純氦氣，柱流速1.3 mL·min-1；進樣口溫度：240 ℃，高壓不分流進樣；進樣量：1 μL；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持1 min，以30 ℃·min-1升至120 ℃，以10 ℃·min-1升至160℃，以2 ℃·min-1升至230 ℃，以15 ℃·min-1升至300 ℃，保持6 min，以20 ℃·min-1升至320 ℃，保持3 min。

電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：200 ℃；接口溫度：250 ℃。

2.6.2 LC-MS/MS分析條件

色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(1.6 μm，2.1 mm×150 mm， CORTECSTM UPLC C18)。

流動相：流動相 A為0.1%甲酸(含5 mmol·L-1甲酸銨)溶液，流動相 B為95 %乙腈溶液(含0.1%甲酸和5 mmol·L-1甲酸銨)，梯度洗脫為0～0.2 min，70%A；0.2～10 min，70%～0%A；10～12 min，0%A；12～13 min，0%～70%A；13～17 min，70%A。流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣室溫度：10℃；進樣量：2 μL；離子源：電噴霧(ESI)，正離子模式；監(jiān)測模式：多反應監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓：2.50 kV；錐孔電壓：30.00 V；離子源溫度：150 ℃；去溶劑溫度：550 ℃；錐孔氣：150 L·Hr-1；去溶劑氣：1 000 L·Hr-1；碰撞氣：0.14 mL·min-1；氣簾氣：138 kPa；碰撞氣：48 kPa。

2.7 供試品溶液的制備

2.7.1 供試品溶液的提取

精密稱定供試品粉末5.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入乙腈30 mL，室溫條件下超聲提取15 min，離心，取上清液，同法提取2次，合并上清液，40 ℃條件下減壓濃縮至近干，以乙腈為溶劑溶解，定容至10 mL棕色容量瓶中，渦旋混勻，即得。

2.7.2 供試品溶液的凈化

凈化1:移取2.7.1提取項下制備的溶液，以微孔濾膜濾過，精密移取2 mL，置于以乙腈：甲苯(3∶1)混合溶液10 mL預洗過的石墨碳黑固相萃取小柱(500 mg)，以20 mL乙腈：甲苯(3∶1)混合溶液進行洗脫，收集洗脫液，氮吹至干，以乙腈為溶劑溶解，定容至2 mL棕色容量瓶內(nèi)，渦旋混勻，即得。凈化2：凈化1所得提取液2 mL，減壓濃縮至干，以環(huán)已烷：乙酸乙酯(1∶1)溶液為溶劑溶解，定容至5 mL棕色容量瓶中，渦旋混勻，以凝膠滲透色譜(GPC)凈化，進樣5 mL，(GPC主要參數(shù)：填料Bio-Beads S-X3 200～400目,凈化柱2.5 mm×40 cm，洗脫參數(shù)：pre run 940 s，main run 1200 s，tail run 300 s)，以環(huán)已烷：乙酸乙酯(1:1)為流動相洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮至近干，乙腈溶解定容至2 mL棕色容量瓶中，供GC-MS/MS和LC-MS/MS分析。

2.8 測定

2.8.1 GC-MS/MS測定

精密量取混合對照品溶液、供試品溶液各2 mL，加GC- MS/ MS分析用內(nèi)標-分析保護劑0.5 mL， 渦旋混勻，進樣，即得。

2.8.2 LC-MS/MS測定

精密量取混合對照品溶液、供試品溶液各2 mL，加GC- MS/ MS分析用內(nèi)標-分析保護劑0.5 mL，渦旋混勻，進樣，即得。

2.8.3 空白基質校正法

對農(nóng)藥殘留進行定量時以空白基質混合標準工作溶液。

2.8.4 空白試驗

除不稱取試樣外，按2.7.1至2.8.2上述步驟進行。

2.9 結果分析方法及定量計算方法

2.9.1 定性分析

若樣品中檢測出的色譜峰的保留時間與混合對照品儲備液中某種農(nóng)藥的色譜峰相一致，且離子對的豐度符合表2要求，則可判定樣品中此種農(nóng)藥檢出。

2.9.2 定量分析

采用內(nèi)標法單離子定量計算，內(nèi)標物為磷酸三苯酯，樣品中農(nóng)藥殘留的峰面積均應在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。

表2 樣品溶液中離子相對豐度的允許偏差范圍

2.9.3 實際樣品分析

應用所建立的實驗方法，測定樣品中的農(nóng)藥種類，需同時滿足2.9.1定性分析和2.9.2定量分析的相關條件，才能確定為樣品中含有此種農(nóng)藥殘留并對其定量。

3 結果與分析

3.1 線性范圍和定量限

用空白基質配制的混合標準溶液濃度，在1～1 000 ng·mL-1范圍內(nèi)，所有農(nóng)藥的線性相關系數(shù)均≥0.995。同時測定多種農(nóng)藥殘留量時，以農(nóng)藥在儀器上最低的響應值計算，農(nóng)藥的檢出限為5倍信噪比(S·N-1)，定量限為10倍信噪比，得到該方法農(nóng)藥的檢出限為0.1～1 ng·mL-1，定量限為0.2～2 ng·mL-1，檢出農(nóng)殘標準曲線見表3。

表3 農(nóng)藥標準曲線

3.2 精密度測定

取濃度為50.0 ng·mL-1的229種農(nóng)藥混合標樣，按2.8測定項下條件，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，峰面積結果相對標準偏差(RSD)均小于5%。

3.3 加樣回收率測定

精密稱定不含農(nóng)藥殘留的供試樣品5.0 g，以2 μg添加水平進行回收試驗，計算229種農(nóng)藥回收率，平行測定3次，平均回收率范圍為85.1%～103.2%，相對標準偏差(RSD)范圍為2.3%～5.1%。

3.4 農(nóng)藥殘留測定結果

按照相應色譜條件對48批女貞子進行農(nóng)藥殘留分析測定，其中僅5種農(nóng)藥殘留被檢出 ,其余農(nóng)藥均未檢出。禾草敵(環(huán)草丹/草達滅)在湖南發(fā)現(xiàn)2批，云南1批；異丙甲草胺在安徽發(fā)現(xiàn)1批；毒死蜱在安徽發(fā)現(xiàn)1批；三唑磷在山西發(fā)現(xiàn)1批；三氟氯氰菊酯在河南發(fā)現(xiàn)1批。除四川地區(qū)外，其余5省區(qū)均檢出含有農(nóng)藥殘留的樣品，具體結果見表4。

表4 女貞子農(nóng)藥殘留測定結果(mg·kg-1)

4 討論

針對女貞子中多種農(nóng)藥所需要的檢測儀器及檢測條件不同，用2種儀器方(GC-MS/MS、HPLC-MS/MS)對229種農(nóng)藥殘留進行了測定。全國范圍內(nèi)的48批女貞子樣品中有7批檢測出農(nóng)藥殘留，檢出農(nóng)藥種類為禾草敵(環(huán)草丹/草達滅)3批、異丙甲草胺1批、毒死蜱1批、三唑磷1批、三氟氯氰菊酯1批，說明女貞子藥材栽培過程中農(nóng)藥使用省份范圍較廣，農(nóng)藥使用種類多樣，其中包含禁止在蔬菜上使用的毒死蜱和三唑磷。因此急需對女貞子藥材栽培中的農(nóng)藥使用種類和殘留量進行規(guī)定。