一測多評法同時測定穿心蓮分散片中4種內酯類成分的含量

姜志遠，劉世萍，馬妍妍，李業雨

(1.黑龍江省農墾總局疾病預防控制中心，黑龍江 哈爾濱 150090；2.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院藥學部，黑龍江 哈爾濱 150001)

穿心蓮分散片是由穿心蓮藥材經提取物后，加入適當的輔料制備的速釋片劑，具有清熱解毒、涼血消腫的藥理作用，在臨床上廣泛地應用于邪毒內盛，感冒發熱，咽喉腫痛，口舌生瘡。穿心蓮分散片的藥效成分有穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、去氧穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯等二萜類內酯化合物。目前穿心蓮分散片的質量標準只設定穿心蓮內酯的含量限值，無法滿足穿心蓮分散片的質量控制要求。由于片劑的多指標成分質量評價及控制需要大量的化學對照品，同時二萜類內酯對照品的化學結構相似、不易制得、價格昂貴等原因，因此對穿心蓮分散片的多指標成分質量評價，在實際生產中很難推廣。本實驗以含量較高、性質穩定的穿心蓮內酯為參照物, 建立穿心蓮分散片4種內酯類成分同步測定的一測多評法, 實現降低檢測成本, 提高含量檢測的質量和效率的目的,為穿心蓮分散片的多指標質量評價及控制提供理論依據和參考方法。

1 儀器與試劑

1.1 藥品試劑

穿心蓮分散片(黑龍江烏蘇里江制藥有限公司哈爾濱分公司提供，規格:0.55 g/片，批號為20170301、20170302、20170303、20170304、20170401、20170402)。對照品穿心蓮內酯(批號:110797-201609)、脫水穿心蓮內酯(批號:110854-201710)購于中國食品藥品檢定研究院。新穿心蓮內酯、去氧穿心蓮內酯對照品購于上海中藥標準化研究中心(經HPLC檢測，面積歸一化法計算,純度>98%)。色譜純乙腈(Merck公司生產),實驗用水為自制的超純水,其他的檢測試劑均為分析純。

1.2 儀器設備

Agilent 1100 型高效液相色譜儀，配有四元梯度泵、在線脫氣機、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器；SHIMADZU LC-2010AHT型液相色譜儀(日本島津制作所)；Phemomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱、Luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱、YMC-Pack C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；BS210S型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；KQ-600型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FiveEasy Plus型pH計(METTLER TOLEDO公司)；Milli-Q A10型超純水系統(默克密理博公司)。

2 方法與結果

2.1 一測多評的實驗方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱：PhemomenexC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水,梯度洗脫:0～52 min,20%～40%乙腈；52～65 min,40%～80%乙腈；流速1.2 mL/min；柱溫25℃；檢測波長205 nm；進樣量10 μL。內酯混合對照品和穿心蓮分散片的HPLC圖見圖1。

圖1 內酯混合對照品(A)和穿心蓮分散片樣品(B)HPLC圖

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取穿心蓮的4種內酯對照品適量，加入甲醇配制成每1 mL中含穿心蓮內酯0.042 1 mg,新穿心蓮內酯0.054 6 mg,去氧穿心蓮內酯0.053 8 mg,脫水穿心蓮內酯0.082 2 mg的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備

取穿心蓮分散片10片，除去包衣，研細，取約0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，振搖使其分散均勻，室溫下浸泡1 h，置數控超聲波清洗器內超聲處理30 min，放冷，再次稱定重量，用甲醇補足減失的重量，振搖使其混合均勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，精密量取續濾液10 mL，置中性氧化鋁柱(200～300目，5 g，柱內徑為1.5 cm)上，用甲醇20 mL洗脫，收集洗脫液，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 內酯成分的線性關系考察

取2.1.2項下的穿心蓮內酯混合對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件分別進樣2、4、6、8、10、12、15、20 μL，測定內酯的峰面積。以內酯的峰面積(A)對進樣量(μg)進行線性回歸。結果見表1。

表1 穿心蓮分散片中4種內酯成分的線性關系

2.1.5 精密度試驗

取2.1.2項下的穿心蓮內酯混合對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件連續進樣10 μL，記錄內酯成分的峰面積。結果穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、去氧穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯等4種成分峰面積的RSD值分別為0.27%,0.34%,0.65%,0.41%,表明儀器精密度良好。

2.1.6 溶液穩定性試驗

取穿心蓮分散片(批號：20170301)，按2.1.3項下的制備方法制備供試品溶液，室溫放置，在0、2、4、8、12、16、24 h分別進樣10 μL，記錄4種內酯類成分的峰面積，結果表明，穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、去氧穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯等4種成分峰面積的RSD值分別為0.37%, 0.52%,0.78%,0.42%, 說明穿心蓮分散片的供試品溶液在24 h內基本穩定。

2.1.7 重復性試驗

取穿心蓮分散片(批號：20170301)，按2.1.3項下的制備方法制備供試品溶液，平行配制6份，按2.1.1項下色譜條件進樣，記錄4種內酯類成分的峰面積。通過計算得到，穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、去氧穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯等4種內酯成分的含量分別為19.56,15.93, 22.27和21.42 mg/g,RSD值分別為0.35%,0.51%,0.86%和0.44%,說明設定的提取方法和檢測方法的重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗

取已知含量的穿心蓮分散片(批號：20170301)細粉0.2 g，精密加入等量的內酯混合對照品, 按2.1.3項下方法制備6份供試品溶液, 依法測定4種內酯成分的含量并計算平均加樣回收率。結果表明，穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯、去氧穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯等4種成分的平均加樣回收率分別為99.07%,98.29%,96.73%,99.24%；RSD值分別為0.36%,0.42%,0.83%,0.75%,說明設定的提取方法和檢測方法的準確度良好。

2.2 內酯成分的相對校正因子計算

取2.1.2項下的穿心蓮內酯混合對照品溶液，按2.1.1項下的色譜條件精密進樣2、5、10、15、20 μL，測定4種內酯類成分的峰面積。然后以穿心蓮內酯為參照物, 根據公式Fr= (An×Ws) / (As×Wn)分別計算新穿心蓮內酯、去氧穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯等3種待測成分的相對校正因子,式中Fr、An、Ws、As、Wn分別為相對校正因子、參照成分的峰面積及其質量濃度(mg/mL)、待測成分的峰面積及其質量濃度(mg/mL)。結果見表2。

表2 穿心蓮分散片中3種待測皂苷類成分的相對校正因子

2.3 內酯成分的相對校正因子重復性考察

2.3.1 不同的檢測儀器對相對校正因子的影響

考察不同品牌的2種色譜儀及3種色譜柱(規格均為:250 mm×4.6 mm,5 μm)對穿心蓮分散片的4種內酯類成分相對校正因子的影響, 結果相對校正因子的RSD<2%, 表明使用不同品牌的檢測儀器及色譜柱均具有良好的重現性。結果見表3。

2.3.2 待測成分色譜峰的定位

以穿心蓮內酯的保留時間為定位標準, 計算新穿心蓮內酯等3種待測成分在不同品牌色譜儀及色譜柱的相對保留時間。結果相對保留時間的RSD<2%, 說明在不同色譜儀和色譜柱下，相對保留時間的變化值較小, 重現性良好。結果見表4。

2.4 樣品的含量測定

按設定的含量測定方法，用一測多評法(QAMS)與外標法(ESM)同時測定6批穿心蓮分散片樣品中穿心蓮內酯、新穿心蓮內酯等4種成分的含量。結果表明，QAMS法測得的含量數據與ESM法測得的結果無顯著差異(RSD<2%)。檢測結果見表5。

表3 不同的液相色譜儀及色譜柱測得的相對校正因子

表4 不同的液相色譜儀及色譜柱測得的相對保留時間

表5 穿心蓮分散片中4種內酯成分的含量測定比較結果表(mg/mL)

3 討論

穿心蓮分散片的化學成分比較單一,主要為二萜內酯類的4種成分。這些成分在同一色譜系統中的出峰時間及峰形等也會受到色譜柱、溶劑、柱溫等諸多因素的影響，因此,待測成分色譜峰的定位非常重要，關系到實驗結果的準確度。本實驗采用穿心蓮內酯的保留時間作為待測成分的定位標準，穿心蓮內酯類成分的相對保留時間在不同的檢測儀器及色譜柱條件下重現性較好(RSD值<2.0% )。

通過方法學研究，不同品牌的2種色譜儀及3種色譜柱對穿心蓮分散片內酯類成分的相對校正因子和相對保留時間影響較小 (RSD<2%)。6批穿心蓮分散片樣品的含量測定結果表明: QAMS法測得的含量數據與ESM法測得的結果無顯著差異,說明建立的QAMS法可對穿心蓮分散片的4種內酯類成分的含量可以實現同步測定, 為穿心蓮分散片的多指標質量控制提供了理論依據和參考方法。