不同品系成年小鼠乳腺干細胞差異分析

尹曉瑩，高慧，孫曉偉，黃長江*

(溫州醫科大學 a 公共衛生與管理學院，b 檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

乳腺是一個動態變化的器官，在青春期、月經周期、懷孕、哺乳和絕經等過程中，組織結構和形態會發生很大變化。乳腺中存在著嚴格的等級結構，正常的乳腺上皮細胞可以根據細胞的特性和在導管中的位置分為組成導管內側面的管腔上皮細胞和組成導管外側面與基底膜相鄰的基底細胞[1]。干細胞是一類具有自我更新復制及多項分化潛能的細胞，處于乳腺細胞等級的最頂級。祖細胞往往具有某種特定的細胞分化潛能但失去了自我更新能力，能夠分化形成1種或幾種低等級細胞。乳腺上皮細胞的這種多層次結構可以大大減少干細胞及祖細胞為維持乳腺組織的周期性變化而產生的消耗。乳腺是一個高度再生的器官，可以通過乳腺干細胞來調控乳腺增生、泌乳和復舊等周期性變化[2]。乳腺干細胞作為調控乳腺發育的重要部分，是乳腺癌細胞起源研究的焦點。自Dontu等[3]研究發現在人乳腺中存在一小群具有自我更新和分化能力的細胞之后，乳腺干細胞開始逐漸進入人們的視野。

長久以來，人們一直在尋找確定干細胞的方法，目前已有一些分子作為干細胞的標志物，但其特異性還有待研究[4]。3D細胞培養又稱三維細胞培養，指在細胞生長過程中提供一個接近體內生存條件的微環境，使細胞處于更加接近人體或者動物體內環境中生長[5]，一般用來驗證干細胞的自我更新和分化能力。本試驗用乳腺干細胞富集的標志物篩選乳腺干細胞，后用3D細胞培養來驗證乳腺干細胞的功能。

據2011年全球癌癥統計報道，在女性中發病率和死亡率高居首位的是乳腺癌[6]，而與之相關的乳腺形態結構變化以及乳腺干細胞組成功能差異則成為了研究的熱點[7-9]。實驗小鼠由于生產繁殖快，成本低，易觀察，平行性好且基因組與人類基因組有較高同源性，被廣泛用作乳腺癌的模式生物。

目前已培育出的實驗小鼠品系有很多，且各有特點。C57BL/6和Balb/c小鼠是應用較廣泛的2個近交系小鼠，ICR小鼠是國際通用的封閉群小鼠，但在乳腺方面比較小鼠品系的差異尤其是比較不同品系小鼠的乳腺干細胞比例等方面差異的研究還比較少。本研究選擇以C57BL/6、Balb/c以及ICR小鼠為實驗動物，研究不同品系小鼠乳腺形態和乳腺干細胞組成方面的差異，從而為乳腺干細胞3D培養的濃度選擇提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

成年C57BL/6、Balb/c，以及ICR小鼠(3～5月齡)購自北京維通利華技術有限公司，在動物房SPF潔凈條件下飼養。整個實驗過程嚴格按照學校動物管理中心實驗動物規則進行飼養。乳腺組織采集以及后續無菌操作均在生物安全柜中進行。

1.1.2 實驗儀器

二氧化碳培養箱和生物安全柜購自美國Thermo公司；光學顯微鏡購自日本尼康公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.1.3 試劑耗材

胭脂紅和硫酸鉀鋁購自美國Sigma公司；Epicult-B基礎培養基、Epicult-B Proliferation Supplement、Mammocult 基礎培養基、Mammocult Proliferation supplement和乳腺上皮細胞富集試劑盒、氯化銨溶液、Trypsin-EDTA (0.25%)、DNase I、Dispase/抗鼠CD24-FITC抗體和抗人/鼠CD49f-PE購自加拿大Stem Cell公司；Streptavidin-APC抗體購自美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；基底膜基質購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠乳腺組織采集

小鼠用異氟烷麻醉后，頸椎脫臼處死。將處死的小鼠用70%酒精消毒后，在生物安全柜中腹部向上固定，用外用手術刀剪開外皮，用內用手術剪刀取下腹股溝處和胸腺處乳腺，備用。

1.2.2 小鼠乳腺整體染色

采集到的乳腺放在載玻片上攤平后放入配置好的染色固定液中，用胭脂紅染液染色過夜，脫水封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 細胞流式分選

將采集到的乳腺放到消化液后在37 ℃、5% CO2培養箱中消化，依次加入氯化銨、胰蛋白酶和Dnase Ⅰ處理，得到單細胞懸液。分別加入不同熒光素標記的cocktail、Streptavidin-APC、CD24-FITC、CD49f-PE抗體，分選得到基底干細胞群(Lin-CD24+CD49fhi)和管腔干細胞群(Lin-CD24hiCD49flo)。

1.2.4 3D細胞培養

將流式分選得到的不同細胞群按照不同的濃度重懸于基底膜基質中，接種于12孔板中，待膠凝固后加入含有血清的培養基，8～9 d補加相同培養基，15 d后觀察并記錄3D結構的形態和大小。

1.3 數據統計分析

采用Graphpad Prism 6軟件對數據進行方差分析，測定結果以平均值±標準差表示。*，**，***分別表示在5%、1%、0.1%水平上差異顯著。

2 結果與分析

2.1 乳腺形態的差異

如圖1所示，C57BL/6和Balb/c小鼠乳腺具有完整清晰的二級和三級分支結構，但ICR小鼠二級結構和三級結構異常，且淋巴結面積增大。

圖1 不同品系小鼠乳腺形態差異(1 000×)

2.2 乳腺干細胞組成的差異

對采集的小鼠乳腺組織進行消化，借助于不同的細胞表面抗原(CD24和CD49f)[10]，經流式細胞儀分選后得到2個細胞亞群，分別為基底干細胞富集的群(Lin-CD24+CD49fhi)和管腔干細胞富集的群(Lin-CD24hiCD49flo)。由圖2可以看出，3個品系小鼠管腔干細胞所占比例以及管腔干細胞和基底干細胞的比均無顯著差異，但ICR小鼠基底干細胞所占比例增加。

2.3 3D形成率的差異

流式分選出的細胞按照不用的濃度接種于基底膜基質中可形成3D結構，統計每1 000個細胞形成的3D數(圖3)。研究發現，不管是基底干細胞還是管腔干細胞，Balb/c小鼠的3D形成率均顯著高于另外兩個品系小鼠。

2.4 3D直徑和形態的差異

基底干細胞形成的3D多為實心結構，管腔干細胞形成的3D多為空心結構[11]。對形成的3D直徑進行測量，同時記錄空心以及實心結構所占比例(圖4)。結果顯示，Balb/c小鼠形成的3D直徑以及結構與另外2個品系都有差異。

圖2 不同品系小鼠乳腺干細胞組成差異

圖3 不同品系小鼠乳腺干細胞3D形成率差異

圖4 不同品系小鼠乳腺干細胞3D直徑及形態差異

3 討論

實驗小鼠廣泛應用于生命科學、醫學、心理學等領域[12-13]，目前已育成1 000多種近交系和獨立的遠交群，可根據不同需要選擇不同品系小鼠。C57BL/6小鼠屬于近交系，是第一種擁有全基因組測序的小鼠，具有乳腺腫瘤和卵巢瘤自然發生率低且化學物質難以誘發乳腺和卵巢腫瘤等特點，經常被用來進行腫瘤學、生理學、免疫學等方面的研究。Balb/c小鼠的遺傳背景為近交系，由親兄弟姐妹遺傳繁殖，因而遺傳基因更純，乳腺腫瘤自然發生率低，但用乳腺腫瘤病毒誘發時發病率高[14]，卵巢、腎上腺和肺部的腫瘤在該小鼠有一定的發生率。ICR小鼠屬于遠親雜交群，具有繁殖力好，對疾病的抵抗力強的特點，主要被用于安全評價、藥理學、毒理學和感染免疫等試驗中。

在使用誘癌劑來建立誘發性乳腺癌動物模型的研究中發現，乳腺癌的發生是通過乳腺導管上皮細胞增生、非典型性增生、癌變，進而演變成為乳腺癌的動態過程進行的[15-16]。乳腺導管結構異常可能是乳腺組織發生病變的參考因素之一。通過乳腺整體染色，結果發現C57BL/6和Balb/c小鼠乳腺導管形態沒有差異，但ICR小鼠乳腺導管形態異常，沒有明顯的二級和三級結構，且淋巴結面積增大，表明ICR小鼠較易引起炎癥反應，ICR小鼠的穩定性低于C57BL/6和Balb/c小鼠。

通過對比3個品系乳腺干細胞3D形成率的差異，從而篩選出12孔板形成3D所需細胞的最適濃度。對于基底干細胞來說，C57BL/6小鼠3D種植最適濃度為每孔30 000個細胞，Balb/c小鼠為每孔5 000個細胞，ICR小鼠為每孔20 000個細胞。對于管腔干細胞來說，C57BL/6小鼠3D種植最適濃度為每孔500個細胞，Balb/c小鼠為每孔500個細胞，ICR小鼠為每孔1 000個細胞。Balb/c小鼠不管是基底干細胞還是管腔干細胞都較易形成3D，C57BL/6小鼠管腔干細胞較易形成3D結構，ICR小鼠與C57和Balb/c小鼠相比，乳腺干細胞形成3D能力相對較弱。Wang等[17]發現不同品系小鼠乳腺干細胞克隆形成率不同，即不同品系小鼠乳腺干細胞自我更新和分化能力不同，這與我們的觀點不謀而合。

在乳腺干細胞形成的3D結構中，C57BL/6和Balb/c小鼠特別是Balb/c小鼠，管腔干細胞形成的實心結構較多，推測可能是空心的3D結構長實了。Lim等[18-19]的研究證明基底細胞樣乳腺癌來源于管腔干細胞，本研究發現，管腔干細胞可以形成基底干細胞形成的實心樣3D結構，這就為管腔干細胞形成基底樣乳腺癌提供了可能。

ICR小鼠作為一個遠交品系，雖然有其優勢，但對于乳腺及其相關研究有一定的局限性，選用C57BL/6和Balb/c小鼠較好。不同品系小鼠其形成3D的能力差異較大，應選擇最適細胞濃度，但這種差異的產生機制仍需我們進一步探索。