不同行為特征肺癌小鼠血管內皮生長因子表達及NK細胞的活性差異研究

臧福才 劉明月 劉敏 唐偉

[摘要] 目的 探討不同行為特征肺癌小鼠血管內皮生長因子（VEGF）的表達及自然殺傷細胞（NK）的活性差異。 方法 Balb/c小鼠80只，雄性，進行曠場試驗，篩選高活躍組和低活躍組小鼠，每組各20只；取處于對數生長期的LLC小鼠肺癌細胞，接種于高活躍組和低活躍組小鼠右腋皮下，建立小鼠肺癌模型。兩組相同條件飼養14 d后，MMT法檢測兩組小鼠脾臟NK細胞的殺傷活性；游標卡尺測量腫瘤的長、短徑，計算腫瘤體積，電子天平稱腫瘤重量；免疫組織化學法檢測兩組小鼠腫瘤組織VEGF蛋白的表達情況。 結果 高活躍組小鼠NK細胞的殺傷活性為（19.73±3.55）%，高于低活躍組[（16.47±3.29）%]，差異有統計學意義（P < 0.05）。高活躍組小鼠腫瘤體積為（0.78±0.14）cm3，低于低活躍組[（0.94±0.24）cm3]，差異有統計學意義（P < 0.05）。高活躍組小鼠腫瘤重量為（0.84±0.19）g，低于低活躍組[（1.00±0.22）g]，差異有統計學意義（P < 0.05）。高活躍組小鼠VEGF陽性表達率為85.0%，明顯低于低活躍組（95.0%），差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 不同活躍程度荷瘤小鼠肺癌組織生長速度不同，可能與小鼠活躍程度影響NK細胞活性、腫瘤組織VEGF蛋白表達有關。

[關鍵詞] 行為特征；肺癌；NK細胞；血管內皮生長因子

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（c）-0018-04

Study on the differences of the expression of vascular endothelial growth factor and the activity of NK cells in lung cancer mice with different behavior characteristics

ZANG Fucai1 LIU Mingyue2 LIU Min1 TANG Wei1

1.Neurology Department， Xinhua Hospital Affiliated to Dalian University， Liaoning Province， Dalian 116021， China； 2.the Second Radiotherapy Department， Handan Central Hospital， Hebei Province， Handan 056000， China

[Abstract] Objective To investigate the differences of the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） and the activity of NK cells in lung cancer mice with different behavior characteristics. Methods Eighty male Balb/c mice were taken open field test to screen high active group and low active group， with 20 mice in each group. The logarithmic phase LLC cells were inoculated in the right axillary subcutaneous of high active group and low active group to establish lung cancer model. After 14 days under the same feeding condition， the killing activity of spleen NK cells in the two groups was detected by MMT method. The long and short diameters of tumor were detected by vernier caliper， the tumor volume was calculated， and the tumor weight was measured by electronic scales. Immunohistochemistry method was used to detect the expression of VEGF in the two groups. Results The killing activity of NK cells in the high active group was （19.73±3.55）%， which was significantly higher than that of low active group [（16.47±3.29）%]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The tumor volume of high active group was （0.78±0.14） cm3， which was smaller than that of low active group [（0.94±0.24） cm3]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The tumor weight of high active group was （0.84±0.19） g， which was lower than that of low active group [（1.00±0.22） g]， the difference was statistically significant （P < 0.05）. The positive expression rate of VEGF in the high active group was 85.0%， which was lower than that of low active group （95.0%）， there was statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion Different activity degrees of tumor-bearing mice have different growth rates of lung cancer tissue， which may be connected with the activity of NK cells and the expression of VEGF protein in tumor tissue.

[Key words] Behavior characteristics； Lung cancer； NK cells； Vascular endothelial growth factor

癌癥是目前對人類健康威脅最大的疾病之一[1]。癌癥也是一種較為明確的身心疾病，個性行為特征和精神心理因素與癌癥的發生、發展有著非常密切的關系。英國學者Greer等結合自己的研究結果，總結了癌癥患者的人格特征：壓抑自己，不善于將內心的感受和不良情緒外泄，對生活事件所產生的負性情緒，壓抑到內心世界[2]。處在開放環境中的動物實驗的特征與人存在相似之處。Dellu等[3]認為高活躍程度的大鼠行為與性格開朗、積極探索的人行為相似，低活躍程度的大鼠與消極態度、高度恐懼感和害羞感特征的人相似。

自然殺傷細胞（NK）既是機體內的自然防御細胞，又兼有重要的免疫調節功能[4]。腫瘤血供豐富，其生長離不開血管的生成，而血管內皮生長因子（VEGF）起關鍵作用[5]。VEGF可誘發腫瘤血管進行性聚集和生成，是目前已知作用最強的血管生成促進因子，與肺癌發生、發展有密切的關系[6-7]。因此闡明不同心理行為特征在癌癥發展過程中的作用、個體行為的差異與腫瘤血管生成能力和免疫應答之間的聯系，探討他們之間的機制對預防、治療癌癥具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Balb/c小鼠80只，雄性，體重18～22 g，SPF級，由大連醫科大學實驗動物中心提供（合格證號：SCXK2015-0002），飼養在24℃、12/12 h光照/黑暗交替的實驗環境中，正常飲食，動物適應1周后開始實驗。本研究經大連大學附屬新華醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 材料及儀器

小鼠LLC肺癌細胞（大連大學附屬中山醫院中心實驗室提供）；胎牛血清（FCS）（杭州四季青生物工程材料有限公司）；RPMI1640培養基（GIBCO公司）；小鼠淋巴細胞分離液（朗頓生物技術有限公司）；兔抗小鼠VEGF多克隆抗體（博士得生物工程有限公司）；SP-9001免疫組化試劑盒（中杉金橋生物技術有限公司）；DAB顯色劑（中杉金橋生物技術有限公司）。NU-4750E型CO2培養箱（LABNET公司）；低溫超速離心機（HITACHI公司）；BHC-1300Ⅱ超凈工作臺（東聯哈爾公司）；Katoo RT2100酶標儀（雷杜生命科學股份有限公司）；石蠟切片機（Leica RM2135德國）；細胞計數板（上海實驗儀器廠）；顯微鏡（OLYMMPUS公司）。

1.3 細胞培養

LLC肺癌細胞為貼壁生長細胞，將其培養于含10%FCS的RPMI1640培養液中（內含100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素），于37℃、5%CO2飽和濕度下培養，每2～3天傳代1次。

1.4 動物分組

曠場試驗：將小鼠輕輕地放于曠場試驗（open field test）反應箱中（曠場試驗箱為50 cm×50 cm×30 cm的木質箱，內部涂為黑色，底面用白線劃分為等大的25個正方形小格子）。讓小鼠隨意活動，記錄每只小鼠3 min內穿越的格子數（由3個實驗員共同完成）。將小鼠第2、3、4天行走距離的平均值作為分組標準：將穿越格子總數處在上四分之一位數的小鼠定義為高活躍組，將穿越格子總數處在下四分之一位數的小鼠定義為低活躍組[8]，每組各20只。

1.5 Balb/c小鼠實體荷瘤模型建立

取處于對數生長期的LLC細胞（長滿80%），成瘤時間為1周，經胰蛋白酶消化后，1200 r/min，離心4 min，用無菌生理鹽水洗滌腫瘤細胞，并調整細胞濃度為1×107/mL以供注射。在無菌條件下接種于小鼠右腋皮下，每只小鼠接種0.2 mL細胞懸液（包含細胞數2×106），注射局部出現明顯皮丘。

1.6 脾臟NK細胞殺傷活性測定

1.6.1 效應細胞制備 頸椎脫臼法處死小鼠后，立即將小鼠浸泡在75%醫用酒精中，2 min后無菌條件下取出小鼠脾臟，磷酸緩沖液（PBS）沖洗3遍，盡量洗凈血細胞，用眼科剪將脾臟剪碎，用10 mL玻璃注射器針芯在200目不銹鋼網篩中研磨、過濾，洗滌3次，制成脾細胞懸液3 mL，將其加入含有小鼠淋巴細胞分離液的試管中，然后1200 r/min離心4 min，收集白膜層，再用PBS洗滌，最后室溫下1640培養基孵育4 h，去除單核細胞，收集細胞懸液，然后1200 r/min離心4 min，收集離心的細胞并調整細胞濃度為5×106/mL。

1.6.2 靶細胞制備 顯微鏡觀察LLC細胞的生長狀態，待LLC細胞生長至對數期時，將其制備LLC單細胞懸液，調整細胞濃度為5×104/mL備用。

1.6.3 細胞毒實驗 將效應細胞、靶細胞各50 μL（效靶比為100∶1）加入到96孔板中，每個樣本設置3個復孔，同時設置單獨效應細胞對照孔和單獨靶細胞對照孔，在37℃、5%CO2的恒溫箱中培養4 h，之后每孔加入5 mg/L的噻唑藍（MTT）10 μL，繼續孵育4 h，之后再加入10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-50%二甲基甲酰胺（DMF）100 μL，待紫色結晶完全溶解，在酶標儀上測570 nm波長的吸光度值（A）。NK細胞殺傷活性（%）=[1-（A效+靶-A效）/A靶]×100%。

1.7 觀察腫瘤組織的形態

處死小鼠后，剝離出腫瘤組織，剝離過程注意與周圍組織有無粘連，肉眼觀察腫瘤組織的大體形態，用電子天平稱瘤重；采用精密游標卡尺測量瘤體最大直徑（a）和最小直徑（b），計算腫瘤體積，并進行兩組間的比較。腫瘤體積=1/2（a×b2）[7]。

1.8 免疫組織化學染色檢測腫瘤組織VEGF蛋白的表達

采用S-P免疫組織化學方法進行染色。VEGF陽性細胞為胞質著色，胞質出現棕黃色顆粒。判斷結果的方法參考相關文獻[9]，由兩名病理醫師雙盲法進行閱片，載玻片上組織染色的陽性反應依據胞質及胞核的染色程度：胞質或胞核有棕黃色或棕褐色顆粒沉著即為陽性染色。低倍鏡下選擇陽性細胞最密集的區域，在高倍鏡下選取5個視野，計數每100個腫瘤細胞陽性細胞百分比，取各視野內陽性細胞百分率的平均值。陽性細胞0～10%為陰性（-）；陽性細胞>10%～30%為弱陽性（+）；陽性細胞>30%～50%為陽性（++）；陽性細胞>50%為強陽性（+++），本研究將（+）～（+++）定義為陽性表達。

1.9 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。所有實驗重復3次，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，等級資料比較采用秩和檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 曠場試驗

Balb/c小鼠在曠場試驗的活動量存在著相當大的差距，穿越的格子數最少的為0個，最多的為139個，其中取高活躍組20只和低活躍組20只。

2.2 Balb/c小鼠肺癌模型建立

Balb/c小鼠接種LLC肺癌細胞后14 d，發現小鼠右腋下出現黃豆粒大小的腫塊，質地堅硬，小鼠的成瘤率為100%。

2.3 兩組小鼠NK細胞殺傷活性比較

高活躍組小鼠NK細胞的殺傷活性為（19.73±3.55）%，高于低活躍組[（16.47±3.29）%]，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.4 兩組腫瘤組織的大體形態

頸椎脫臼法處死小鼠后，剝離腫瘤組織，觀察發現腫瘤組織呈灰紅色，質地較硬，與周圍組織分界不清，存在粘連。高活躍組小鼠瘤體積為（0.78±0.14）cm3，低于低活躍組[（0.94±0.24）cm3]，差異有統計學意義（P < 0.05）；高活躍組小鼠瘤重為（0.84±0.19）g，低于低活躍組[（1.00±0.22）g]，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.5 兩組腫瘤組織中VEGF的表達情況比較

3 討論

癌癥的發生是多階段、復雜的演變過程。它不僅受到物理、化學、生物等因素的影響，同樣也受到精神心理因素的影響。隨著科技水平的進步、人類疾病譜的改變，生物醫學模式逐漸轉變為“生物-心理-社會”醫學模式，精神心理因素對疾病的影響日益受到醫學界的重視[10]。本研究采用小鼠曠場試驗的結果來判別小鼠的活躍程度。曠場試驗又稱敞箱實驗[11]，是根據實驗動物在新奇環境中某些行為發生的頻率和持續的時間等，來反映實驗動物在新奇環境中的自主行為以及以尿便次數來反映緊張度[12-13]。本研究發現，與高活躍組小鼠相比，低活躍組小鼠腫瘤組織重量和體積均較高，說明具有不同行為特征的荷瘤小鼠腫瘤生長速度不同，這也說明穩定的行為特征對腫瘤生長有影響。

腫瘤的發生、發展和轉移與機體的免疫功能低下有關。社會心理因素對機體免疫力的影響主要是通過神經內分泌系統實現的，同時這些免疫因子又作用于中樞神經系統，反饋性對心理和行為特征產生影響，引起心理和行為特征的改變[14]。免疫系統是機體主要的腫瘤防御系統，機體抗腫瘤反應以細胞免疫為主。NK細胞是機體內的自然防御細胞，又兼具重要的免疫調節功能[15]。由于NK細胞的殺傷活性無MHC限制，不依賴抗體，因此稱為自然殺傷細胞，是機體抗腫瘤免疫的第一道防線[16]。長期壓抑的負性情緒通過中樞神經系統激活下丘腦，引起糖皮質激素釋放入血。糖皮質激素對幾乎所有免疫細胞均有影響，尤其是引起NK細胞活性下降明顯，使NK細胞對腫瘤細胞的殺傷活性下降，最終導致腫瘤的發生[17]。

脾臟是機體重要的免疫器官，脾臟中含有豐富的NK細胞，且實驗時易獲得，因此本研究選擇測量脾臟中NK細胞的殺傷活性來反映機體的免疫力。本研究為了探討不同行為特征對機體免疫功能的影響，檢測高、低活躍兩組小鼠脾臟NK細胞的殺傷活性，結果發現高活躍組小鼠脾臟NK細胞殺傷活性明顯較高，說明不同行為特征肺癌模型小鼠NK細胞殺傷活性具有一定的差異性。

腫瘤的生長依賴于血管的生成，新生的腫瘤血管為腫瘤生長提供營養物質和氧氣。腫瘤細胞和其間質細胞產生的促血管內皮生長因子可誘發血管進行性生成和聚集。其中VEGF的作用是關鍵環節。VEGF是較強的促血管生成因子，在腫瘤生長過程中，原癌基因的激活和突變、抑癌基因的失活等都可導致VEGF的大量分泌[18]。Neufeld等[19]研究證明機體大量分泌的VEGF能特異性刺激血管內皮細胞增殖，在實體腫瘤的血管生成中起著關鍵性作用。Demasi等[20]研究表明，腫瘤生長及轉移首先要有新血管的生成和構建，否則腫瘤生長及轉移的可能性都較小。Amkraut等[21]的研究結果指出不同活躍能力的大鼠其整體血管生成能力不同，低活躍大鼠的血管生成能力較高，這與本研究結果一致。本研究采用免疫組織化學法檢測高、低活躍組荷瘤小鼠腫瘤組織中VEGF蛋白的表達，通過對比VEGF蛋白表達的陽性率反映腫瘤血管生成的能力。結果顯示，與高活躍組小鼠比較，低活躍組小鼠腫瘤組織VEGF蛋白表達明顯較高，這也提示低活躍組荷瘤小鼠腫瘤血管生成能力較強。穩定的行為特征與腫瘤生長存在著密切的關系，這使我們將更加關注行為特征與腫瘤的關系，指導未來進一步研究。

[參考文獻]

[1] Nakaya N. Effect of psychosocial factors on cancer risk and survival [J]. J Epidemiol，2014，24（1）：1-6.

[2] 李心天.醫學心理學[M].北京：北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，1998：372-374.

[3] Dellu F，Piazza PV，Mayo W，et al. Novelty- seeking in rats-biobehavioral characteristics and possible relationship with the sensation-seeking trait in man [J]. Neuropsychobiology，1996，34（3）：136-145.

[4] Marcus A，Gowen BG，Thompson TW，et al. Chapter three-recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells [J]. Adv Immunol，2014，122：91-128.

[5] 朱靜，萬遠廉，劉玉村，等.血管生成與腫瘤[J].現代腫瘤醫學，2007，15（3）：428-430.

[6] 張朝清，劉麗，吳定濱.VEGF及微血管密度在非小細胞肺癌中的表達及VEGF與臨床病理特征的關系[J].海南醫學，2017，28（14）：2254-2256.

[7] 任衛華.血管內皮生長因子及其受體系統與腫瘤生長相關性的研究進展[J].腫瘤學雜志，2015，21（7）：611-614.

[8] 秦竹，秦越，籍莉，等.麻黃附子細辛湯對心境障礙抑郁型大鼠模型行為學影響的研究[J].江西中醫藥大學學報，2017，29（2）：70-71.

[9] 許良中，楊文濤.免疫組織化學反應結果的判定標準[J].中國癌癥雜志，1996，6（4）：229-230.

[10] Borras JM，Albreht T，Auudisio R，et al. Policy statement on multidisciplinary cancer care [J]. Eur J Cancer，2014，50（3）：475-480.

[11] 李旻.自擬解郁方抗抑郁作用的實驗研究[J].中醫臨床研究，2017，9（17）：7-8.

[12] 袁樹民，張曉娟，張海濤.阿爾茨海默病模型小鼠自主活動能力的分析[J].中國比較醫學雜志，2010，20（4）：5-8.

[13] Li CQ，Zhang JW，Dai RP，et al. Surgical incision induces anxiety-like behavior and amygdala sensitization：effects of morphine and gabapentin [J]. Pain Res Treat，2010，70（58）：74.

[14] 劉志敏，劉巍.惡性腫瘤患者社會心理問題的研究進展[J].臨床腫瘤學雜志，2015，20（1）：87-90.

[15] Marcus A，Gowen BG，Thompson TW，et al. Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells [J]. Adv Immunol，2014，122（1）：91-128.

[16] 遲海濤，李霞，趙泰成.豐富環境對肺癌荷瘤小鼠腫瘤組織NK細胞活性、KI67蛋白表達的影響[J].現代腫瘤醫學，2017，25（16）：2557-2560.

[17] Ben-Eliyahu S，Page GG，Schleifer SJ. Stress，NK cells，and cancer：still a promissory [J]. Brain Behav Immun，2007，21（7）：881-887.

[18] 袁明，王瓊，吳丹，等.小細胞肺癌患者癌組織中CD44及血清血管內皮生長因子的表達及臨床意義[J].中國綜合臨床，2017，33（7）：625-627.

[19] Neufeld G，Kessler O，Vadasz Z，et al. The contribution of proangiogenic factors to the progession of malignant disease：role of vascular endothelial growth factor and its receptors [J]. Surg Oncol N Am，2001，10（2）：339-356.

[20] Demasi AP，Silva CA，Silva AD，et al. Expression of the vascular endothelial growth factor and angiopoietins in mucoepidermoid carcinoma of salivary gland [J]. Head Neck Pathol，2012，6（1）：10-15.

[21] Amkraut A，Solomon GF. Stress and murine sarcoma virus（moloney）-induced tumors [J]. Cancer Res，1972，32（7）：1428-1433.

（收稿日期：2017-11-30 本文編輯：張瑜杰）