高效液相色譜—質譜聯用法測定二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ）中格列本脲含量

韓東

摘 要：目的：建立測定二甲雙胍格列本脲膠囊中格列本脲含量的高效液相色譜-質譜聯用法。方法：采用HPLC-MS儀、Xbridge C18色譜柱（4.6×75mm，2.5μm），樣品經多反應監測MRM掃描模式測定格列本脲含量。結果：樣品質量濃度保持在1.011～30.33μg/ml范圍下表現出良好的峰面積線性關系，且監測過程中樣品回收率高達99.99%，提示測定穩定性較為理想。結論：應用高效液相色譜-質譜聯用法測定二甲雙胍格列本脲膠囊中格列本脲含量效果顯著，可提供快速、準確、靈敏的檢測結果，值得在今后實際工作中作為二甲雙胍格列本脲膠囊的質量控制方法。

關鍵詞：二甲雙胍格列本脲；高效液相色譜-質譜聯用法；格列本脲含量測定價值

中圖分類號：R927.2 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2018）13-0183-02

二甲雙胍格列本脲膠囊作為目前針對2型糖尿病的主要治療藥物之一，是非胰島素依賴型糖尿病的一線治療藥物，具有起效快、降糖效果好等特點。目前藥品檢測過程中多是通過高效液相色譜法來進行格列本脲含量的檢測工作，但是該檢測模式靈敏度并不理想，對于藥品的定性鑒別以及含量測定也無法獲得良好的測定結果[1]。本文將探討高效液相色譜-質譜聯用檢測二甲雙胍格列本脲膠囊中格列本脲含量的實際效果，為今后二甲雙胍格列本脲膠囊質量控制工作提供切實詳盡的參考依據，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

儀器選用Waters I Class型高效液相色譜儀（美國沃特世科技有限公司）、Waters XEVO TQ-S型三重四級桿質譜儀（美國沃特世科技有限公司）、XS205型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

格列本脲對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100135-201105）、二甲雙胍格列本脲膠囊（生產廠家：吉林萬通藥業集團，批號為160905、160906、160907，藥品中格列本脲標示量為1.25mg），甲醇為色譜純（MREDA TECHNOLOGY 批號016953）、甲酸為分析純（MREDA TECHNOLOGY 批號017096）。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

色譜柱選擇十八烷基鍵合硅膠柱Waters Xbridge BEH-C18（4.6×75mm，2.5μm），流動相選擇甲醇-0.1%甲酸（40：60），干燥氣以及霧化氣均為氮氣。質譜采取電噴霧離子源、正離子進行掃描，通過多反應監測方式（MRM）行定量分析。參數設置如下：流速0.2ml/min、柱溫30℃、進樣量1μl；干燥器溫度300℃、流量10l/min；毛細管電壓4500V、噴嘴電壓2000V、掃描時間0.2s。上述參數設置完成后行離子全掃描，可見格列本脲打碎并呈現出3個比較明顯的二級碎片離子，該離子具備較強響應值、豐度比穩定。由此提示，上述檢測模式對該類型化合物的專屬性鑒別提供較為理想的數據依據[2]。

2.2 溶液制備

（1）對照品溶液：制備對照品溶液時，精密稱定格列本脲對照品12.58mg置50ml容量瓶中，加入流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液待用（250μg/ml）。精密量取上述對照品貯備液5ml置于50ml容量瓶中并加入流動相稀釋至相應刻度，搖勻后作為對照品溶液；（2）供試品溶液：將20粒樣品內容物取出并精密稱定、研細，稱取上述適量細粉（約相當于格列本脲5mg）并置于100ml容量瓶中，緩慢加入流動相溶液使其稀釋至刻度線，搖勻，過濾。取續濾液5ml置10ml容量瓶中，再次加入流動相稀釋至刻度線并搖勻，將其作為供試品溶液；（3）陰性對照品溶液：按照質量標準中處方比例相同方法制備陰性樣品，根據制備供試品溶液的方法制備法陰性對照品溶液，該陰性對照品溶液中不包含有格列本脲。

2.3 方法學考察

（1）干擾實驗：分別取適量的對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照品溶液作為實驗溶液，利用HPLC-MS/MS定量離子流色譜圖對上述三種溶液進行有效測定并記錄相關數據，一般情況下組分出峰的區域未見干擾峰，此外陰性對照基底的響應值較低，提示處方中其他成分以及輔料未對樣品的測定造成相應干擾。（2）線性關系考察：精密量取對照品貯備溶液0.5，1.0，2.5，5.0，10.0以及15.0ml，將其分別置于100ml容量瓶中并加入流動相稀釋至刻度，搖勻后將其制備成格列本脲對照品系列溶液。根據擬定色譜質譜條件對其進行分析并記錄定量離子總粒子流色譜圖，測定過程中需以格列本脲峰面積作為縱坐標（Y軸）、格列本脲質量溶度作為橫坐標（X軸），進行線性回歸計算，在此基礎上得到回歸方程Y=100789X-900.0，r=0.9997（n=6）。分析該線性回歸方程計算結果可知，格列本脲質量濃度保持在1.011～30.33μg/ml范圍下表現出良好的峰面積線性關系。繼續稀釋對照品系列溶液并分析可知，于信噪比（S/N）10情況下格列本脲的質量濃度值為0.4ng/ml。（3）精密度試驗：取同一對照品溶液連續進行6次進樣處理，計算格列本脲峰面積，結果為RSD=0.11%（n=6），表明儀器具備有良好的檢測精密度。（4）重復性試驗：選取6份二甲雙胍格列本脲膠囊并依次測定其含量，結果表明格列本脲含量的平均含量為97.53%，RSD為0.34%（n=6），表明了該方法具備有良好的重復性。（5）穩定性試驗：取同一供試品溶液進行本次研究，將其置于室溫下并分別于0，2，4，6，8，12h進行測定，應用外標法計算其含量，結果表明RSD為0.50%（n=6），這表明了供試品溶液在12h內均能夠保持有良好的穩定性能。（6）加樣回收試驗：取20粒已知含量的二甲雙胍格列本脲膠囊內容物作為試驗用藥，對其進行研細處理之后，分別精密稱取適量的細粉（約相當于格列本脲5mg），細粉稱量完成后置于25ml容量瓶中，然后分別精密加入對照品4mg、5mg以及6mg各三份，加入流動相溶解并稀釋至相應刻度，搖勻后濾過處理。精密量取續濾液5ml，分別置9個100ml容量瓶，加入流動相，稀釋處理至預定刻度，精密吸取1μl并測定，在此基礎上計算格列本脲加樣回收率[3]，具體的計算結果如表1所示。

2.4 樣品的含量測定

對樣品中格列本脲的含量進行測定的過程中，需選取3批二甲雙胍格列本脲膠囊作為試驗材料，根據相應標準同法制備測定供試品溶液，進樣1μl之后進行測定，測量并記錄離子離子流色譜圖，再根據外標法計算其含量，結果批次編號分別為1，2，3的樣品含量分別為標示量的98.69%、98.68%以及98.22%，這也就表明了該樣品中的樣品含量達到了預定的標準[4]。

3 討論

3.1 色譜以及質譜條件的選擇

本次研究中選擇甲醇-0.1%甲酸（40：60）作為流動相，發現當應用此流動相時所能夠獲取的理論板數是最高的，質譜響應值也相對更高，具體的理論板數甚至還能夠達到6000以上。因此提示，在具體的檢測過程中可直接將甲醇-0.1%甲酸（40：60）流動相作為檢測的條件，并能夠在此基礎上進行二級質譜的不斷優化與完善。只有在合理的色譜以及質譜條件選擇基礎上才能夠使格列本脲獲得較為穩定的碎片離子，從而取得一個良好的檢測效果。

3.2 各國的藥典對比

就格列本脲的含量測定方式進行研究，在中國藥典、日本藥典以及歐洲藥典中，均采用HPLC法以及滴定法來對格列本脲的含量進行測定。其中在應用HPLC法來進行測定的過程中，HPLC流動相分別為磷酸二氫銨溶液（取1.725g硫酸二氫銨加水300ml溶解，之后用磷酸調節pH值，直到其pH值達到3.5）-甲醇（3：5）以及1.36%磷酸二氫銨溶液（具體制法同上，其中pH值應用磷酸調節到3.0）-乙腈（53：47）。但是在液質聯用法中僅可將揮發性成分作為流動相，因此在具體檢測過程中也就存在有比較多的限制性。較之于各國藥典中的記載，本研究中所選取的測定模式更加適用于液質聯用法的測定，在對格列本脲進行測量的過程中具備更高的準確性以及靈敏度。

3.3 方法評價

本次研究所涉及的色譜系統及質譜系統測定二甲雙胍格列本脲膠囊中格列本脲含量具有理想的應用效果，并能夠為該類型制劑今后的分析、開發、代謝動力學研究等工作提供重要的參考價值。

參考文獻

[1]關金龍.高效液相色譜-質譜聯用法在分析檢測中的運用分析[J].機電信息，2015，（5）：40-42.

[2]藍際榮，楊安平，吳來燕，等.基于固相萃取/高效液相色譜-質譜聯用法的微囊藻毒素代謝產物制備及應用[J].分析測試學報，2015，（6）：664-669.

[3]劉信奎，王萌萌，張連成，等.高效液相色譜-質譜聯用法測定二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅰ）中格列本脲含量[J].中國藥業，2017，（6）：25-27.

[4]謝強勝，張子璇，張中湖，等.超高效液相色譜法測定唐解膠囊中非法添加降糖類化學藥物[J].藥學研究，2017，（4）：200-202.