補氣升提法對糖尿病復(fù)雜性肛瘺患者術(shù)后創(chuàng)面局部微環(huán)境影響的研究

楊英楠，干 丹，王振宜

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437)

肛瘺是肛腸科的常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率高達8.6/100 000～10/100 000[1]。根據(jù)內(nèi)口和外口的數(shù)量，可將其分為單純性肛瘺和復(fù)雜性肛瘺。復(fù)雜性肛瘺是指肛管直腸瘺，主要為肛管和直腸受到炎癥侵犯，導(dǎo)致周圍組織破潰形成瘺，內(nèi)口或外口數(shù)量2個以上(含2個)，手術(shù)是其主要治療手段。糖尿病是臨床常見的代謝紊亂性疾病，具有發(fā)病率高、難愈、終生性等特點[2]。而肛瘺并發(fā)糖尿病則增加了創(chuàng)面感染的風(fēng)險，并有可能延緩創(chuàng)面愈合。2015年8月—2016年4月，筆者通過高通量測序技術(shù)評估了補氣升提法對糖尿病復(fù)雜性肛瘺患者術(shù)后創(chuàng)面局部微環(huán)境的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 臨床資料

1.1一般資料 選擇上述時期在本院治療的復(fù)雜性肛瘺患者24例，均符合《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[3]中復(fù)雜性肛瘺診斷標(biāo)準(zhǔn)，均為男性，年齡18～65歲，血常規(guī)、凝血功能、肝腎功能檢查均正常，自愿參與葡萄糖(空腹)檢測，自愿加入本試驗并簽署知情同意書。排除妊娠期婦女，對觀察藥物過敏者，合并血液、心腦血管、肝臟、腎臟等嚴(yán)重原發(fā)性疾病和炎性腸病、結(jié)核性肛瘺、惡性腫瘤、精神異常者，最近3個月內(nèi)參與過其他臨床實驗者。血糖檢測并參照文獻[4]標(biāo)準(zhǔn)證實存在糖尿病者16例，將此16例患者隨機分為2組：治療組8例，年齡(46.87±13.87)歲；陽性對照組8例，年齡(49.63±16.32)歲。不伴糖尿病的8例作為陰性對照組，年齡(37.85±11.27)歲。3組患者年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2治療方法 3組患者均由肛腸科手術(shù)經(jīng)驗豐富的高年資醫(yī)師行復(fù)雜性肛瘺切除術(shù)，伴糖尿病者在術(shù)前邀請內(nèi)科醫(yī)生會診， 并予以口服降糖藥物或者胰島素注射控制血糖水平，控制空腹血糖(FPG)4.4～6.1 mmol/L ，餐后2 h血糖(2hPG)4.4～8.0 mmol/L，糖化血紅蛋白(HbAlc)<6.5%。3組患者術(shù)后均給予左氧氟沙星注射液0.4 g加入生理鹽水250 mL中靜脈滴注，每日1次，連續(xù)2 d。每日8:00和15:00各換藥1次：常規(guī)清潔創(chuàng)面，外用馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏，用消毒紗布及無菌棉塊包扎固定。換藥后予局部紅外線照射2～3 min。治療組在上述治療基礎(chǔ)上給予芪參固托湯口服,組方:太子參30 g、黃芪30 g、黨參30 g、山藥30 g、白芍30 g、白術(shù)30 g、升麻30 g、柴胡20 g、當(dāng)歸20 g、陳皮15 g、炙甘草15 g，由本院制劑室制備，具體方法：將上述中藥進行沖洗過濾后，放入全自動中藥煎藥機(型號JYJ-25)，280 g 中藥加水820 mL(煎藥機加水量=吸收常量1.5 mL/g×飲片質(zhì)量+預(yù)計取得藥液量+耗損量200 mL)，溫度105 ℃，壓力0.15 MPa，煎煮30 min，共煎煮2次，過濾濃縮后每10 mL加入70%乙醇靜置24 h，重復(fù)上述步驟，回收乙醇，適量蒸餾水稀釋，最后每劑中藥留取約200 mL藥液，真空包裝，統(tǒng)一由中藥房配送至病房護理部。護理部經(jīng)隔水密封加熱至35～40 ℃，護理部統(tǒng)一于每日早、晚飯后30 min發(fā)放至患者處并觀察其服用完畢。

1.3觀察項目及檢測方法 在術(shù)后第1天及第14天8:00未行創(chuàng)面清潔、消毒、換藥、紅外線照射等基礎(chǔ)治療前，用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格無菌長棉簽蘸取術(shù)后創(chuàng)面局部分泌物，采用高通量測序方法分析創(chuàng)面分泌物菌群的組成情況。

1.3.1DNA提取 將所取術(shù)后創(chuàng)面局部分泌物立即放入-80 ℃冰箱速凍，送至實驗室提取DNA，余備管樣本存于-80 ℃冰箱保存。糞便DNA按照QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 標(biāo)準(zhǔn)流程進行抽提。

1.3.216S rRNA-V1-V3區(qū)的PCR擴增及測序采用二次PCR建庫測序流程：①DNA質(zhì)檢及Qubit定量；②第一輪PCR；③PCR產(chǎn)物純化；④Qubit定量及混庫；⑤第二輪PCR；⑥Beads二次純化；⑦Qubit定量及Q-PCR質(zhì)檢；⑧Miseq測序；⑨數(shù)據(jù)分析。

1.3.3生物信息學(xué)分析 ①數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化；②Illumina Miseq測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，結(jié)果以FASTQ文件格式來存儲；③原始數(shù)據(jù)質(zhì)量分析；④通過生物信息統(tǒng)計學(xué)的方法，對所有測序reads的每個circle進行堿基分布和質(zhì)量波動的統(tǒng)計，直觀反映出測序樣本的測序質(zhì)量和文庫構(gòu)建質(zhì)量；⑤原始數(shù)據(jù)質(zhì)量控制；⑥使用cutadapt v1.3檢測接頭和修剪末端，使用QIIME v1.8.0篩選序列和嵌合體，嵌合體去除使用QIIME v1.8.0的Usearch算法，參數(shù)默認(rèn)；⑦使用QIIME分析流程進行分析；⑧OTU聚類：使用pick_open_reference方式進行OTU聚類，聚類算法使用Uclust，數(shù)據(jù)庫使用Greengenes 2013-08 release (http://greengenes.lbl.gov/Download/)版本，相似度閾值為97%，對所有序列進行OTU劃分并進行生物信息統(tǒng)計分析，其余參數(shù)為QIIME默認(rèn)參數(shù)；⑨alpha_diversity分析：使用軟件QIIME v1.8.0 alpha_diversity分析模塊評價各個樣本或者分組的5個alpha多樣性指數(shù)(shannon,chao1,observed_species,goods_coverage,simpson)；⑩稀釋性曲線：使用QIIME v1.8.0 alpha_rarefaction.py做5個alpha多樣性指數(shù)的稀釋性曲線；Beta多樣性分析：分別計算 Unweighted/Weighted Unifrac來表征Beta diversity；upgma_tree 目錄：使用UPGMA bootstrap tree 分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計軟件采用SPSS 22.0.0.0(64位版本)。對樣本數(shù)量及數(shù)據(jù)分布進行初步判斷后，采用非參數(shù)檢驗中的秩和檢驗。生物學(xué)信息統(tǒng)計采用 QIIME v1.8.0軟件，選用rdp_classifier v2.2算法。

2 結(jié) 果

2.1實驗完成情況 治療組退出1例，陽性對照組脫落1例，陰性對照組剔除1例，共21例患者完成實驗。

2.2樣本測序純化處理前后的序列 術(shù)后第1天及第14天共獲得未加工序列590287，經(jīng)純化處理后得到純凈序列478587，質(zhì)控后優(yōu)化序列為81.08%，樣本質(zhì)量良好，可順利進行后續(xù)測序，結(jié)果可信。見表1。

2.3各樣本物種豐度及多樣性分析 術(shù)后第14天，治療組和陰性對照組各指數(shù)均有一定程度上升，但與術(shù)后第1天比較變化較小；陽性對照組各指數(shù)變化明顯，除goods_coverage外，其他指數(shù)均顯著上升，見表2和表3。組間分析顯示，陽性對照組物種數(shù)目最少，治療組其次，陰性對照組較高，術(shù)后第14天陽性對照組最高，陽性對照組治療前后差異最大，增長達到10倍，見圖1及圖2；治療組和陰性對照組菌群較為穩(wěn)定，陽性對照組菌群波動巨大，這種菌群波動的差異可能與糖尿病具有相關(guān)性，同時對疾病的恢復(fù)有一定的影響。

表1 各組樣本測序純化處理前后的序列

圖1 樣本observed_species

圖2 組間observed_species

2.4門水平菌群結(jié)構(gòu) 在門水平上，完成研究的21例患者98%的菌群屬于以下5個門：70%以上屬于厚壁菌門(Firmicutes)、12%屬于變形菌門(Proteobacteria)、5%屬于放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)、約3%屬于藍藻門(Cyanobacteria)，其余則屬于無法確定的分類(如0D1、TM7等)，見圖3。3組術(shù)后第1天及第14天組內(nèi)的菌群分布基本符合上述規(guī)律，厚壁菌門最豐富，變形菌門次之，放線菌門與擬桿菌門相當(dāng)，藍藻門所占比重最少，但是陽性對照組術(shù)后第1天組內(nèi)菌群分布明顯不同，除了厚壁菌門最豐富之外，藍藻門所占比重其次，其余3個菌門所占比重相當(dāng)；術(shù)后第14天，治療組和陰性對照組厚壁菌門、擬桿菌門比重顯著增加，變形菌門比重顯著下降，放線菌門、藍藻門變化相對較小，陽性對照組則厚壁菌門增加更為明顯，變形菌門比重與其他2組相反呈增加趨勢，其他3個菌門不同程度下降，見表4。

表2 各樣本5個alpha多樣性指數(shù)

表3 各組5個alpha多樣性指數(shù)

圖3 門水平各樣品間菌群分布情況

2.5綱水平菌群結(jié)構(gòu) 除不明確的菌群外，主要是以下10個菌綱占優(yōu)勢：厚壁菌門的Bacilli、Clostridia、Erysipelotrichi，變形菌門的Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria，放線菌門的Actinobacteria、Coriobacteriia，擬桿菌門的Bacteroidia以及藍藻門的Chloroplast。其中最為優(yōu)勢的是Bacilli及Clostridia菌綱，但在各樣品間的具體分布差異也相對較大，以Bacilli菌綱為例其在對應(yīng)樣品中所占比例為0.41%～90.94%，差異巨大，見圖4。3組中，治療組最優(yōu)勢菌綱為Bacilli，其次為Clostridia；陽性對照組治療前后差異較大，術(shù)后第1天Bacilli比例最高、其次是Chloroplast，術(shù)后第14天Clostridia比例最高、其次是Bacilli；陰性對照組最優(yōu)勢的是Clostridia，其次是Bacilli；術(shù)后第14天，3組Bacilli、Clostridia均有不同程度提高，但陽性對照組Clostridia成倍提高，明顯與其他2組不同；治療組和陰性對照組Bacteroidia均有提高，而陽性對照組呈下降趨勢；治療組和陰性對照組Gammaproteobacteria均有下降，而陽性對照組則顯著上升；3組Chloroplast均下降，但陽性對照組下降幅度尤為顯著，見表5。

2.6目水平菌群結(jié)構(gòu) 除不明確的菌群外，主要是以下12個目的菌群占總菌群98%以上：Lactobacillales、Clostridiales、Bacteroidales、Enterobacteriales、Streptophyta、Actinomycetales、Bifidobacteriales、Burkholderiales、Coriobacteriales、Erysipelotrichales、Rhizobiales、Bacillales。其中最為優(yōu)勢的是Lactobacillales、Clostridiales菌目。但在各樣品間的具體分布差異也相對較大，以Lactobacillales為例其在對應(yīng)樣品中所占比例為0.37%～90.7%，差異巨大。3組中，治療組最優(yōu)勢菌目為Bacilli中的Lactobacillales，其次為Clostridia中的Clostridiales；陽性對照組治療前后差異較大，術(shù)后第1天Bacilli中的Lactobacillales比例最高、其次是Chloroplast中的Streptophyta，術(shù)后第14天Clostridia中的Clostridiales比例最高、其次是Bacilli中的Lactobacillales；陰性對照組最優(yōu)勢的是Clostridia中的Clostridiales，其次是Bacilli中的Lactobacillales。術(shù)后第14天，3組Bacilli中的Lactobacillales、Clostridia中的Clostridiales均有不同程度提高，但陽性對照組Clostridia中的Streptophyta及Gammaproteobacteria中的Enterobacteriales成倍提高，明顯與其他2組不同；治療組和陰性對照組Bacteroidia中的Lactobacillales均有提高，而陽性對照組呈下降趨勢；治療組和陰性對照組Gammaproteobacteria中的Enterobacteriales均有下降，而陽性對照組則顯著上升；3組Chloroplast中的Streptophyta均下降，但陽性對照組下降幅度尤為顯著；治療組和陰性對照組Actinobacteria中的Bifidobacteriales變化不大，而陽性對照組則顯著下降，見表6。

圖4 綱水平各樣品間菌綱分布情況

Taxon治療組術(shù)后第1天術(shù)后第14天陽性對照組術(shù)后第1天術(shù)后第14天陰性對照組術(shù)后第1天術(shù)后第14天Firmicutes-Bacilli68.6669.8921.3426.4023.9928.35Firmicutes-Clostridia11.6512.6316.9537.0938.3244.22Bacteroidetes-Bacteroidia1.572.6113.642.973.524.77Actinobacteria-Actinobacteria2.231.6013.445.671.901.07Proteobacteria-Gammaproteobacteria6.042.645.1913.3015.683.61Cyanobacteria-Chloroplast0.110.0317.311.210.530.18Firmicutes;Other4.947.100.163.073.344.34Proteobacteria-Betaproteobacteria1.571.105.892.354.115.80Other;Other1.951.650.862.244.412.53Actinobacteria-Coriobacteriia0.090.030.431.511.692.56Firmicutes-Erysipelotrichi0.350.411.190.660.951.62Proteobacteria-Alphaproteobacteria0.470.182.752.950.710.61

表6 目水平3組術(shù)后不同時間菌目分布情況 %

2.7各分類水平匯總分析 將門、綱、目、科、屬、種6個分類水平數(shù)據(jù)進行匯總后，進行分析得出餅圖5，可以直觀反映出各菌群之間的相對優(yōu)勢情況及菌群間的從屬關(guān)系。

圖5 6個分類水平匯總餅圖

3 討 論

腸道微生態(tài)與人類壽命、健康密切相關(guān)，構(gòu)成腸道微生態(tài)的已知細(xì)菌達500余種，正常情況下這些微生物相互依存，又相互制約，保持?jǐn)?shù)量和比例的穩(wěn)定，共同維持腸道的微生態(tài)平衡，對人體的營養(yǎng)吸收、免疫調(diào)節(jié)等生理功能有重要作用，對一些代謝性疾病和消化道腫瘤有一定拮抗作用[5-6]。

肛瘺術(shù)后創(chuàng)面直接與外界空氣、腸液等接觸，具有開放式、污染式等特征，其有菌創(chuàng)面愈合的快慢可能與腸道菌群、飲食物過敏、炎性腸病、糖尿病等相關(guān)。糖尿病患者肛瘺術(shù)后創(chuàng)面難愈是臨床常見的一個難題,因此，本研究選取合并有糖尿病的肛瘺患者作為研究對象，探討創(chuàng)面局部微環(huán)境中菌群與肛瘺術(shù)后創(chuàng)面愈合情況的相關(guān)性。

近年來，越來越多的研究認(rèn)為腸道菌群是控制體質(zhì)量和能量代謝的一個重要因素，并且與肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)[7]。糖尿病患者由于長期處于高糖狀態(tài)，導(dǎo)致血漿滲透壓升高，吞噬細(xì)胞對病菌的殺傷及吞噬能力受到影響，自身免疫功能降低，腸道功能紊亂，導(dǎo)致腸道菌群失衡[8]。許小津等[9]認(rèn)為2型糖尿病患者腸道雙歧桿菌總菌數(shù)量減少，即雙歧桿菌整體數(shù)量減少。研究表明，糞擬桿菌、變異梭狀芽孢桿菌、大腸埃希菌、脫硫弧菌屬、加氏乳桿菌、變形鏈球菌和副流感嗜血桿菌等有促糖尿病發(fā)生的作用，而梭狀芽孢桿菌、直腸真桿菌、羅斯氏菌、疣微菌科、Akkermansiamuciniphila和普氏糞桿菌等有抗糖尿病的作用[10-11]。邵加慶[12]認(rèn)為，腸道菌群與能量貯存與代謝、腸道旁分泌與內(nèi)分泌均息息相關(guān)，腸道菌群通過其基因、中間產(chǎn)物和代謝活力等影響著人體的代謝、活動、體質(zhì)量、免疫等多方面，從而對健康和疾病產(chǎn)生雙向影響。而中醫(yī)研究表明,氣機的升降理論能調(diào)節(jié)腸道菌群，有維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)作用[13]。本研究選用的是我科聞茂康教授的經(jīng)驗方芪參固托方，有補氣升提、健脾養(yǎng)血之功效。方中的黃芪、黨參、太子參、山藥等均有控制血糖的作用，全方可以在一定程度上調(diào)節(jié)患者血糖水平，從而影響患者基礎(chǔ)代謝環(huán)境，調(diào)節(jié)腸道菌群。

本研究發(fā)現(xiàn),在門水平3組術(shù)后第1天和術(shù)后第14天的菌群分布以厚壁菌門最豐富，變形菌門次之，放線菌門與擬桿菌門相當(dāng)，藍藻門所占比重最少。術(shù)后第14天，陰性對照組厚壁菌門、擬桿菌門比重顯著增加，變形菌門比重顯著下降，放線菌門、藍藻門變化相對較小；陽性對照組則厚壁菌門增加尤為明顯，增幅高達70%；變形菌門比重與其他2組相反，呈增加趨勢；其他3個菌門不同程度下降。已有腸道菌群方面的研究認(rèn)為腸道優(yōu)勢菌門有5～9個[14]，本研究中得出的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門等5個菌門，與已有研究成果相符，而其中又以厚壁菌門最為突出，這可能與創(chuàng)面所在位置具有一定的相關(guān)性，由于其余腸道相通的特點，因此其菌群受到腸道菌群的影響。而陽性對照組的菌群結(jié)構(gòu)變化情況印證了已有的糖尿病腸道菌群方面的相關(guān)研究結(jié)果[15]，厚壁菌門相較于陰性對照組偏低，擬桿菌門所占比重下降，放線菌門高于陰性對照組；但同樣是糖尿病患者，治療組的變化趨勢則不同于陽性對照組，可能與中藥具有一定的相關(guān)性。

本實驗通過高通量測序技術(shù)證實糖尿病復(fù)雜性肛瘺患者術(shù)后創(chuàng)面局部微環(huán)境中的菌群與不伴糖尿病患者的菌群多樣性和種群結(jié)構(gòu)明顯不同，特別是在門水平上；而補氣升提法可使糖尿病復(fù)雜性肛瘺患者術(shù)后創(chuàng)面局部微環(huán)境中的菌群物種、豐度分布發(fā)生變化，由門水平至目水平上將其調(diào)節(jié)到與不伴糖尿病患者菌群相似。由于本研究受樣本數(shù)量及時間限制，尚未對補氣升提法改善糖尿病復(fù)雜性肛瘺患者術(shù)后創(chuàng)面局部微環(huán)境中菌群的具體機制進行研究，未來可加大樣本數(shù)量，進一步研究探討。