火把花根對糖尿病腎病大鼠腎臟Angptl2和NF-κB表達的影響

方玲娜，盧 冰，張 莉，沈莉雯，沈鮮安，朱文華，嚴 言，唐楓燕，鐘 紹

(江蘇大學昆山醫院，江蘇 昆山 215300)

糖尿病腎病是常見的糖尿病慢性并發癥，多種細胞因子和炎癥因子參與其發病和發展[1]。血管生成素樣蛋白2(Angptl2)是血管生成素樣蛋白之一，在心臟、腎臟、脂肪等組織表達，能夠促進內皮細胞出芽[2]，與血管生成有關，且其參與炎癥反應，是炎癥反應通路中的遞質[3]；而核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)是炎癥反應通路中重要的調節因子。火把花根具有抗炎、抗免疫作用，本研究通過觀察火把花根對糖尿病腎病大鼠蛋白尿及腎臟組織中Angptl2和NF-κB的影響，探討了火把花根對糖尿病腎病的保護作用，現報道如下。

1 實驗資料

1.1實驗動物 8周齡Wistar雄性大鼠40只，體質量(200±10)g，購于常州卡文斯實驗動物有限公司，動物合格證號：SYXK(蘇)2011-0003。

1.2藥物及試劑和儀器 火把花根粉(陜西斯諾特生物技術有限公司)，厄貝沙坦片(安博維，Sanofi-anvitis公司，法國)。鏈脲佐菌素(STZ，Sigma公司，美國)，PAS染液試劑盒(南京建成科技公司)，一抗兔抗大鼠Angptl-2和兔抗大鼠NF-κB抗體(abcam公司，英國)，二抗羊抗兔抗體(abcam公司，英國)，倒置顯微鏡(Leica公司，德國)，透視電鏡(JEOL公司，日本)。

1.3實驗方法 Wistar大鼠適應性喂養7 d，從中隨機取10只作為正常組，其余大鼠空腹一次性腹腔注射STZ 55 mg/kg(溶于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液，pH 4.4)制備糖尿病腎病模型，以尿蛋白試紙測尿蛋白()為造模成功。將造模成功的27只大鼠隨機分為安慰劑組、厄貝沙坦組和火把花根組，每組9只，室溫下標準飼料飼養，自由飲水，4周后，厄貝沙坦組和火把花根組分別灌胃厄貝沙坦50 mg/kg、火把花根4 g/kg(參照文獻[4]中給藥劑量)，正常組和安慰劑組灌胃等量蒸餾水，均1次/d，干預8周。

1.4標本收集與指標測定 將大鼠置于代謝籠內留取24 h尿液，測定各組灌胃后每周尿蛋白水平。灌胃結束后處死大鼠，取腎臟。

1.4.1腎臟組織病理觀察 ①取部分腎臟組織經甲醛固定，石蠟包埋后切片，脫蠟，水洗后分別進行PAS和HE染色，光鏡下觀察各組腎臟組織的病理改變。②取部分腎臟組織用5%戊二醛固定，常規脫水、包埋、切片，采用JEM1230透視電鏡觀察。

1.4.2腎臟組織中Angptl2和NF-κB表達檢測采用二步法，腎組織石蠟切片脫蠟水化，固定后通過3% H2O2/PBS滅活內源性過氧化物酶，PBS漂洗后浸入檸檬酸鹽緩沖液修復，5%BSA封閉，加入稀釋后一抗(稀釋比例1∶100)4 ℃過夜孵育，洗片后再加入稀釋后二抗(稀釋比例1∶1 000)37 ℃孵育1 h，DAB顯色后滴加蘇木素復染，中性樹膠封片。采用Image-Pro Plus圖像分析系統計算視野中Angptl2和NF-κB的光密度值，計算平均值。

2 結 果

2.1各組大鼠尿蛋白水平比較 灌胃第1周，安慰劑組、厄貝沙坦組和火把花根組尿蛋白水平均明顯高于正常組(P均<0.05)。第2周厄貝沙坦組和火把花根組尿蛋白水平均開始下降，均明顯低于安慰劑組(P均<0.05)，但灌胃前4周厄貝沙坦組和火把花根組尿蛋白水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；第5周火把花根組尿蛋白水平明顯低于厄貝沙坦組(P<0.05)；第7周和第8周，厄貝沙坦組和火把花根組尿蛋白水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

2.2各組大鼠腎臟組織PAS染色表現 安慰劑組糖原顆粒沉著較多，厄貝沙坦組和火把花根組減少。見圖1～4。

2.3各組大鼠腎臟組織HE染色表現 安慰劑組腎小球體積肥大呈腫脹狀態，腎小囊腔狹窄，呈裂隙狀，腎小管上皮細胞排列紊亂、肥大；厄貝沙坦組基底膜輕度增厚，系膜基質輕度增生；火把花根組僅見系膜基質輕度增加。見圖5～8。

表1 各組大鼠每周尿蛋白水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與安慰組比較，P<0.05；③與厄貝沙坦組比較，P<0.05。

圖1 正常組大鼠腎臟組織PAS染色表現(×400)

圖2 安慰劑組大鼠腎臟組織PAS染色表現(×400)

圖3 厄貝沙坦組大鼠腎臟組織PAS染色表現(×400)

圖4 火把花根組大鼠腎臟組織PAS染色表現(×400)

圖5 正常組大鼠腎臟組織HE染色表現(×400)

圖6 安慰劑組大鼠腎臟組織HE染色表現(×400)

圖7 厄貝沙坦組大鼠腎臟組織HE染色表現(×400)

圖8 火把花根組大鼠腎臟組織HE染色表現(×400)

2.4各組大鼠腎臟組織透視電鏡表現 安慰劑組大鼠腎小球毛細血管襻官腔擴張明顯，基底膜呈階段性增厚，足細胞足突排列紊亂、增寬、節段性融合；厄貝沙坦組和火把花根組大鼠腎小球病變程度及范圍相對減輕。見圖9～12。

圖9 正常組大鼠腎臟組織透視電鏡表現(×1 700)

圖10 安慰劑組大鼠腎臟組織透視電鏡表現(×1 700)

圖11 厄貝沙坦組大鼠腎臟組織透視電鏡表現(×1 700)

圖12 火把花根組大鼠腎臟組織透視電鏡表現(×1 700)

2.5各組大鼠Angptl2和NF-κB表達水平 安慰劑組Angptl2和NF-κB表達水平均明顯高于正常組(P均<0.05)；厄貝沙坦組和火把花根組Angptl2和NF-κB表達水平均明顯低于安慰劑組(P均<0.05)。厄貝沙坦組和火把花根組Angptl2表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)，火把花根組NF-κB表達水平明顯低于厄貝沙坦組(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠Angptl2和NF-κB表達水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與安慰組比較，P<0.05；③與厄貝沙坦組比較，P<0.05。

3 討 論

糖尿病屬于中醫“消渴”范疇，消渴并發“水腫”“水病”和“尿濁”等與糖尿病腎病相近，并認為“氣陰兩虛”是消渴腎病的重要病機[5]。中醫治療糖尿病腎病主要使用益氣滋陰、活血化瘀類藥物，常見的藥物有黃芪、雷公藤等。火把花根含有雷公藤堿、雷公藤內酯等多種成分，臨床上常用火把花根提取物治療自身免疫性疾病如類風濕關節炎、強直性脊柱炎、銀屑病[6-8]。王麗娟等[9]研究發現，火把花根能夠降低糖尿病腎病患者尿蛋白，可能與火把花根抑制TGF-β1、上調肝細胞生長因子，減輕腎小球硬化和腎間質纖維化有關。

尿蛋白是糖尿病腎病發展的獨立危險因素，尿蛋白的發生與足細胞損傷、腎小球血流動力學異常、腎小球肥大、系膜區基質的擴大等因素有關，足細胞數量和形態的改變是尿蛋白發生的重要因素[10-11]。鄭敬民等[12]研究發現，糖尿病腎病小鼠足細胞內有Angptl2表達，提示足細胞產生分泌Angptl2。吳義超等[13]研究發現，糖尿病腎病患者Angptl2表達增加；Angptl2參與足細胞損傷，且與尿白蛋白成正相關[14-16]。本實驗研究發現，火把花根有明顯降低糖尿病腎病大鼠尿蛋白的作用，在試驗早期降低尿蛋白的作用較厄貝沙坦更為明顯，且隨著火把花根干預時間延長，大鼠尿蛋白呈線性下降；透視電鏡顯示安慰劑組足細胞足突排列紊亂、增寬，階段性融合，喪失正常結構，厄貝沙坦組和火把花根組病變程度則相對減輕；免疫組化分析發現，火把花根組大鼠腎臟組織中Angptl2表達水平明顯下降。提示火把花根可能通過抑制Angptl2表達保護足細胞，減少尿蛋白。

NF-κB存在于多種組織細胞中，是多信號轉導通路的交叉點之一，它調控和參與機體應激、炎癥反應。NF-κB能夠調節包括足細胞在內的多種腎臟組織細胞表達和分泌炎癥因子，而高血糖可激活NF-κB，從而上調IL-1β和TNF-α水平，在糖尿病腎病發生中起關鍵作用[17-18]。本實驗研究發現，糖尿病腎病大鼠腎臟組織中NF-κB表達增加，與周誼夏等[19]觀察結果相似；火把花根組中NF-κB表達明顯減少，并且低于厄貝沙坦組，提示火把花根可通過抑制NF-κB表達減輕腎臟組織的炎癥反應，延緩糖尿病腎病的進展，該作用可能較厄貝沙坦更為明顯。

綜上所述，火把花根能夠降低糖尿病腎病大鼠尿蛋白水平，具有治療糖尿病腎病的作用，該作用可能與其保護足細胞、抑制炎癥反應有關，其中的信號通路需要進一步試驗明確。