電針對血管性認知障礙大鼠學習記憶能力及腦組織炎癥因子的影響

馮琪　尚華杰　劉美琪

摘要：目的 觀察電針對血管性認知障礙（VCI）大鼠學習記憶能力和大腦皮層炎癥因子的影響，探討針刺防治VCI的作用機制。方法 采用頸內(nèi)動脈微栓子體外注入法制備VCI大鼠模型。將成模大鼠隨機分為模型組、陽性藥組和電針組，同時取正常大鼠作為對照組。造模3 d后，陽性藥組給予鹽酸多奈哌齊藥液灌胃，電針組針刺“百會”“足三里”。治療結(jié)束后，采用Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力，ELISA檢測大鼠腦組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-1β的含量。結(jié)果 定位巡航實驗隨訓練次數(shù)的增加，陽性藥組和電針組大鼠尋找平臺平均逃避潛伏期較模型組均有不同程度的縮短；空間探索實驗陽性藥組和電針組較模型組首次穿越平臺所需時間顯著縮短；與對照組比較，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著升高；與模型組比較，陽性藥組和電針組TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著降低。結(jié)論 電針“百會”“足三里”可能通過降低VCI大鼠大腦皮層TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，改善大鼠學習記憶能力。

關鍵詞：血管性認知障礙；電針；百會；足三里；炎癥因子；學習記憶能力；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.06.010

中圖分類號：R245 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）06-0039-05

Effects of Electroacupuncture on Learning and Memory Ability and Brain Inflammatory Factor in Rats with Vascular Cognitive Impairment

FENG Qi， SHANG Hua-jie， LIU Mei-qi， LIN Zhao-yan， QIU Ling-hui， ZANG Ying-ying，

CHEN Xin-li， LIU Yue-ting， CHEN Hui-yun， WANG Zhao-yang

School of Acupuncture and Moxibustion， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China

Abstract： Objective To observe the effects of electroacupuncture on the learning and memory ability and cerebral cortex inflammatory factor of rats with vascular cognitive impairment （VCI）； To discuss the mechanism of electroacupuncture for preventing and treating VCI. Methods VCI rat models were made in microemboli injection through internal carotid artery method. The successful modeled rats were randomly divided into model group， positive medicine group and electroacupuncture group， and normal rats were taken as control group. Three days after rat models were established， the positive medicine group was given donepezil hydrochlorideby gavage， and electroacupuncture group was given electroacupuncture at “Baihui” and “Zusanli” acupoints. After treatment， the learning and memory ability was detected by Morris water maze test. The contents of TNF-α， IL-6 and IL-1β in rat brain tissue were detected by ELISA. Results The water maze results showed that with the increase of the number of training， the average escape latency of rats to find platform in positive medicine group and electroacupuncture group all had different degrees of shortening in positioning cruise experiment； in space exploration experiment， positive medicine group and electroacupuncture group to cross the platform area for the first time were significantly reduced compared with the model group； compared with the control group， the contents of TNF-α， IL-6 and IL-1β in the model group were increased significantly； compared with the model group， the contents of TNF-α， IL-6 and IL-β in

基金項目：國家自然科學基金重點項目（81430100）

通訊作者：王朝陽，E-mail：xlywzy@163.com

postive medicine group and electroacupuncture group were decreased. Conclusion Electroacupuncture at “Baihui” and “Zusanli” acupoints can decrease the contents of TNF-α， IL-1 and IL-6 in the cortex of VCI rats， and improve the learning and memory ability of rats.

Keywords： vascular cognitive impairment； electroacupuncture； Baihui； Zusanli； inflammatory factor； learning and memory ability； rats

腔隙性腦梗死是大腦或腦干深部的小穿通動脈管壁發(fā)生病變，最終管腔閉塞導致的缺血性微梗死，是腦梗死的常見亞型之一。血管性認知功能障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是由所有腦血管危險因素、明顯或不明顯的腦血管病引起的從輕度認知障礙到癡呆的一大類綜合征。腔隙性腦梗死是導致VCI的主要原因之一，腔隙性腦梗死后2年內(nèi)約有60%患者出現(xiàn)VCI[1-2]。研究表明，急慢性腦缺血會引起腦內(nèi)的炎癥反應，產(chǎn)生大量損害神經(jīng)細胞的炎癥因子，是造成中樞神經(jīng)損傷的重要原因[3]。督脈入絡腦，百會為督脈陽氣至盛之穴，是治療呆證第一穴；足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，為治療VCI配穴的首選[4]。針刺百會、足三里治療VCI療效顯著，能明顯改善患者癥狀和認知功能[5-6]，增強大鼠海馬神經(jīng)元突觸傳遞分子蛋白激酶C的活性[7]，改善慢性腦低灌注引發(fā)的大鼠前額葉皮層神經(jīng)元損傷，抑制氧化應激，減輕學習記憶的損害[8-9]。然而，目前針刺“百會”“足三里”對VCI大鼠腦組織炎癥因子的影響尚不明確。本研究制備VCI大鼠模型，模擬多發(fā)性腔隙性腦梗死發(fā)病過程，選取“百會”“足三里”行電針干預，觀察大鼠學習記憶能力及腦組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-1β的含量變化，探討針刺防治VCI的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

健康SD大鼠80只，SPF級，雌雄各半，2月齡，體質(zhì)量（180±20）g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗動物中心SPF級動物實驗室，屏障環(huán)境[SYXK（京）2014-0008]，飼養(yǎng)溫度（24±2）℃，相對濕度40%～60%，光照周期為明暗各12 h，實驗過程中各組大鼠自由攝食飲水，術前12 h禁食。

1.2 藥物

鹽酸多奈哌齊片，衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，批號1609047。

1.3 主要試劑與儀器

BCA蛋白濃度測定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），高效RIPA裂解液（北京索萊寶科技有限公司），TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒（碧云天生物技術有限公司），IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒（碧云天生物技術有限公司），IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒（碧云天生物技術有限公司）。華佗牌電針治療儀（SDZ-Ⅱ，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），0.25 mm×25 mm華佗牌無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），Morris水迷宮實驗系統(tǒng)（DMS-2，中國醫(yī)學科學院藥物研究所），電子天平（BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），離心機（5424R，Eppendorf），電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9145A型，上海一恒科技有限公司），酶標儀（ELX800，美國BIO-TEK儀器有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組及造模

隨機選取SD大鼠雌雄各6只作為對照組，其余68只采用頸內(nèi)動脈微栓子體外注入法制備VCI大鼠模型[10-11]。造模過程中死亡25只，失敗7只，造模成功納入實驗大鼠36只，按照隨機數(shù)字表法將其分配至模型組、陽性藥組和電針組，每組12只。本研究經(jīng)動物倫理委員會審核，符合動物保護、福利和倫理原則，符合國家實驗動物福利倫理的相關規(guī)定。

取同種大鼠血液，置于烘箱內(nèi)無菌干燥成塊，研碎，200 ?m篩孔過篩備用，使用時用無菌生理鹽水加血凝塊勻漿制成混懸液，栓子濃度為30 mg/mL。大鼠術前12 h禁食，腹腔注射水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉，大鼠仰臥固定于固定臺上，充分暴露頸部，頸部正中常規(guī)備皮，PV碘消毒后行頸部正中切開術，暴露頸總動脈，暫時夾閉，于左側(cè)頸外動脈處逆行插管，注入栓子鹽水0.3 mL后，立即結(jié)扎左側(cè)頸外動脈，同時開放頸總動脈，使栓子由頸內(nèi)動脈進入腦內(nèi)，形成多發(fā)性腔隙性腦梗死。

2.2 模型判定標準

術后觀察造模大鼠行為表現(xiàn)，采用Longa 5分法進行神經(jīng)功能缺損評分[12]。5分：無任何自發(fā)活動；4分：自發(fā)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒；3分：拖住大鼠尾部向后拉時，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；2分：拖住大鼠尾部向后拉時，對側(cè)肢體無力；1分：對側(cè)肢體屈曲；0分：正常。大鼠評分1～4分者納入實驗。

2.3 干預

對照組：不造模，不針刺，常規(guī)飼養(yǎng)。模型組：造模，不針刺，常規(guī)飼養(yǎng)。陽性藥組：予鹽酸多奈哌齊藥液0.520 6 mg/kg灌胃，相當于臨床60 kg體質(zhì)量人日用藥的6.25倍，每日1次，連續(xù)30 d。電針組：成模3 d后開始針刺，參考《大鼠穴位圖譜的研制》[13]選取“百會”“足三里”，“百會”位于大鼠頂骨正中，兩耳連線的中點，“足三里”位于大鼠后膝關節(jié)外下方，當腓骨小頭下約5 mm處。針刺時采用自制鼠套固定大鼠，充分暴露大鼠頭部和四肢，取0.25 mm×25 mm華佗牌一次性無菌針灸針，“百會”需固定大鼠頭部，沿大鼠頭部正中向前或向后平刺2～3 mm，“百會”旁非經(jīng)非穴處再平刺一針，連接電極。“足三里”需觸摸到大鼠腓骨小頭，在腓骨小頭下約5 mm處直刺5 mm，取雙側(cè)。針刺后連接電針治療儀，在大鼠頭部及雙側(cè)“足三里”各接入一對電極，電針頻率2～100 Hz，疏密波，強度以局部肌肉抖動且大鼠安靜耐受為度，每次30 min，每日1次，連續(xù)30 d。

2.4 行為學檢測

采用Morris水迷宮實驗評價大鼠學習記憶能力，所有大鼠于治療結(jié)束后次日開始進行水迷宮測試。包括定位巡航實驗、空間探索實驗和可視平臺實驗，檢測大鼠空間學習和記憶能力。

定位巡航實驗：目標象限位于第二象限，平臺位于水下2 cm，大鼠從目標象限以外的任意象限入水，記錄大鼠找到平臺的時間（逃避潛伏期），每日2次，間隔4 h，連續(xù)5 d。

空間探索實驗：第6日撤去平臺，將大鼠從目標象限以外的任意一象限入水，測定大鼠首次穿越平臺區(qū)域的時間。

可視平臺實驗：第7日，移動平臺位于第一象限并使其頂部高于水面2 cm，記錄大鼠找到平臺時間。

2.5 指標檢測

水迷宮實驗結(jié)束后次日，10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭處死大鼠，迅速分離大鼠腦組織，置于冰臺，快速剝離額葉皮層放入液氮中迅速冷凍，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩＝M織樣本按10 mL/g加入RIPA高效裂解液裂解，冰浴條件下玻璃勻漿器勻漿至充分裂解，將裂解后樣品4 ℃、12 000×g離心5 min，取上清液，置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)錅y。BCA法蛋白濃度定量后，采用雙抗夾心ELISA檢測TNF-α、IL-1β、IL-6含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，采用方差分析和非參數(shù)檢驗，定位巡航實驗采用重復測量數(shù)據(jù)的方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 Morris水迷宮實驗結(jié)果

4.1.1 定位巡航實驗

與正常組比較，模型組大鼠尋找平臺平均逃避潛伏期明顯延長（P<0.01）；隨著訓練次數(shù)的增加，陽性藥組和電針組大鼠尋找平臺平均逃避潛伏期較模型組均有不同程度的縮短。結(jié)果見表1。

4.1.2 空間探索實驗

與正常組比較，模型組大鼠首次穿越平臺所需時間明顯延長（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和電針組大鼠首次穿越平臺所需時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）；電針組大鼠首次穿越平臺時間與陽性藥組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

4.1.3 可視空間實驗

各治療組大鼠逃避潛伏期與模型組比較無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明水迷宮實驗測試學習記憶能力與大鼠的視力無關。結(jié)果見表3。

4.2 電針對模型大鼠腦組織腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、白細胞介素-1β含量的影響

與正常組比較，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，陽性藥組和電針組TNF-α、IL-6、IL-1β含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）；電針組大鼠腦組織IL-6含量較陽性藥組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)果見表4。

5 討論

VCI在中醫(yī)古代文獻中無對應病名，且與阿爾茨海默病未作明確區(qū)分，二者均歸屬老年性呆病的范疇，根據(jù)發(fā)病癥狀的特點常以“善忘”“喜忘”“不慧”“健忘”“多忘”“好忘”“癡呆”“呆癡”“愚癡”“神呆”“言語錯忘”等記載。現(xiàn)代中醫(yī)認為，中風與VCI發(fā)病相關。中風導致的VCI多因中風病后痰瘀交結(jié)不去，阻塞腦竅，進而痰濁阻塞機竅，影響患者的認知功能，加之中風患者多為老年人，常伴有久病氣血虛弱，精氣不足，腦神失養(yǎng)，或肝腎不足，腦髓不充，引起智能衰退。腦為“元神之府”，督脈入絡腦，治療與腦有關的疾病首選督脈穴，百會為督脈陽氣至盛之穴，是督脈、足太陽膀胱經(jīng)、足少陽膽經(jīng)、手少陽三焦經(jīng)和足厥陰肝經(jīng)的交會穴，又名“三陽五會”，為督脈第一要穴，具有益氣升陽、醒腦安神、交通陰陽、開竅通絡之功效。中風后常伴有半身不遂，陽明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，取陽明經(jīng)穴能夠通暢氣血，扶助正氣，使機體的功能逐漸恢復，足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，具有通經(jīng)活絡、調(diào)暢氣血、扶正祛邪的功效。二穴相配遵循遠近配穴的原則，具有健腦調(diào)神、扶正通絡之功效。有研究表明，針刺“百會”“足三里”能顯著降低大鼠血清和腦組織TNF-α、IL-1β和IL-6的含量[14]，與本研究結(jié)果一致。

本實驗結(jié)果顯示，電針“百會”“足三里”可降低大鼠額葉皮層TNF-α、IL-1β、IL-6含量，減輕炎癥因子對腦組織的損傷，改善大鼠的學習記憶能力。TNF-α是由單核巨噬細胞分泌的炎癥因子，是激活炎癥因子級聯(lián)反應的主要物質(zhì)，出現(xiàn)較早并迅速達到高峰，半衰期很短，可誘發(fā)“次級”炎癥因子（如IL-1、IL-6、IL-8等）產(chǎn)生，由此激發(fā)炎癥連鎖反應，導致繼發(fā)性腦損傷。IL-1β是IL-1的主要存在形式，IL-1β是炎癥反應早期產(chǎn)生的細胞因子，具有觸發(fā)炎癥反應并級聯(lián)放大炎癥過程的作用，參與腦水腫的形成，血腦屏障的破壞，誘導其他炎癥介質(zhì)的大量表達，造成組織的損傷。生理情況下，IL-6在腦組織中含量極低，主要分布于海馬、下丘腦、皮質(zhì)等區(qū)域，在腦梗死狀態(tài)下，促炎細胞因子IL-1β率先被激活，促進機體釋放IL-6，破壞微循環(huán)，損傷神經(jīng)細胞，加重腦水腫，通過活化血小板和粒細胞加重腦組織的損傷，并且誘導產(chǎn)生更多的炎癥介質(zhì)[15]。IL-6含量越高，可能導致的炎癥因子瀑布反應越強，造成的炎癥損傷越重。

腔隙性腦梗死是腦血管病的重要組成部分，是導致VCI的主要原因。腦缺血缺氧是目前VCI公認的主要病因，急慢性腦缺血導致的炎癥反應產(chǎn)生大量對神經(jīng)有毒害作用的炎癥因子，造成腦組織的損傷。本研究模擬多發(fā)性腔隙性腦梗死的病理過程，結(jié)果表明，大鼠皮層TNF-α、IL-6、IL-1β含量顯著升高，影響大鼠的學習記憶能力。電針“百會”“足三里”可降低大鼠皮層TNF-α、IL-6和IL-1β含量，提高大鼠學習記憶能力，緩解中樞系統(tǒng)的炎癥反應，這可能是電針抗炎、減輕中樞神經(jīng)損傷、治療VCI的機制之一。

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（收稿日期：2017-12-27）

（修回日期：2018-01-19；編輯：華強）