黃芩素對喉癌細胞周期、凋亡率及細胞核DNA的影響

孫吉鳳　劉劍凱

【摘要】 目的：探索黃芩素（baicalein，BAI）對喉癌細胞周期、凋亡率及細胞核DNA的影響。方法：體外培養的Hep-2細胞，加入不同濃度的BAI，藥物作用后，用MTT法檢測細胞增殖情況；用流式細胞術檢測對細胞周期及細胞凋亡率的影響；用DNA瓊脂糖凝膠電泳法檢測對凋亡細胞核DNA的影響。結果：MTT法檢測到BAI（10、20、40、80 μmol/L）可明顯抑制Hep-2細胞的增殖，呈時間-劑量依賴性（P<0.05）；FCM法檢測到BAI（40 μmol/L）可誘使細胞阻滯在S期，凋亡率升高（P<0.05）；BAI（40、80 μmol/L）可誘使細胞核DNA形成“梯狀”條帶；呈時間-劑量依賴性（P<0.05）。結論：一定濃度的BAI，可抑制人喉癌Hep-2細胞增殖，誘導細胞阻滯在S期，細胞凋亡率升高，晚期凋亡細胞核DNA斷裂形成DNA Ladder。

【關鍵詞】 黃芩素； 喉癌； 細胞周期； 凋亡率

Effect of Baicalein on Cell Cycle，Apoptosis Rate，DNA of Apoptotic Cells in Laryngeal Cancer Cells/SUN Jifeng，LIU Jiankai.//Medical Innovation of China，2018，15（16）：0-016

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Baicalein（BAI） on cell cycle，apoptosis rate，DNA of apoptotic cells in laryngealcancer cells.Method：Hep-2 cells were exposed to BAI at various concentrations respectively，in vitro.MTT assay was used to determine cell proliferation；flow cytometry were used to analyze cell cycle and apoptosis rate；the effect on the DNA was detected by agarose gel electrophoresis.Result：MTT assay showed that the proliferation of Hep-2 cells were significantly inhibited by BAI（10，20，40 and 80 μmol/L），in a time and dose dependent manner（P<0.05）.Hep-2 cells are arrested at the S phase and the apoptosis rate was significantly increased by BAI（40 μmol/L）through flow cytometry（P<0.05）.DNA ladder in Hep-2 cells was induced by BAI（40，80 μmol/L）.Conclusion：BAI can inhibite proliferation of Hep-2 cells，increase the apoptosis rate，induce Hep-2 cells in S phase and late apoptotic cells DNA broken into DNA Ladder.

【Key words】 Baicalein； Laryngeal cancer； Cell cycle； Apoptosis rate

First-authors address：Changchun Medicial College，Changchun 130031，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.16.004

喉癌是喉部最常見的惡性腫瘤，其發病率目前有明顯增高趨勢[1-7]。隨著分子生物學、細胞生物學、腫瘤學等相關生命學科的迅猛發展，正在逐步揭示惡性腫瘤的本質，同時抗腫瘤藥物研究也進入了一個新階段。尋找有效的防癌、抗癌藥物一直是腫瘤防治研究的一個重要方面。

黃芩素（baicalein，BAI）是我國傳統中藥黃芩的主要的有效成分，屬于黃酮類化合物，具有抑菌、免疫調節、清除自由基和降血脂等多種藥理作用[8-10]。近年來發現黃芩素可能是一種潛在的新型的植物抗腫瘤藥物。已有研究表明，黃芩素在體外對于腫瘤細胞系具有抑制作用，而對正常組織細胞幾無毒性[11-14]。本實驗中，不同濃度黃芩素對人喉癌Hep-2細胞周期時相、凋亡率、凋亡細胞DNA影響展開研究，從而為進一步闡明黃芩素的抗喉癌機制及臨床應用提供實驗依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 藥品 BAI購自美國SIGMA公司，用DMSO溶解后置于-20 ℃冰箱保存，實驗時稀釋至所需濃度。四甲基偶氮唑鹽（MTT）、碘化丙啶（PI）、二甲基亞砜（DMSO）購于北京鼎國生物技術公司。人喉癌Hep-2細胞購自上海細胞生物研究所。RPMI1640培養基購于Gibco/BRL公司。DNA Ladder抽提試劑盒購于碧云天生物技術公司。

1.2 細胞培養 喉癌細胞株Hep-2于含5%胎牛血清FBS、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養液，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養傳代，24～48 h傳代一次，傳代濃度為5×105個/mL。

1.3 MTT法檢測細胞增殖抑制率 收集對數期生長的Hep-2細胞，調整為細胞濃度5×104個/mL接種于96孔培養板中，每孔加200 μL細胞懸液，培養24 h后，同步化培養24 h，再加入終濃度分別為10、20、40、80 μmol/L的BAI繼續培養。設置陰性對照組，只加入溶劑DMSO；設置空白對照組，只加入培養液。每組設5個復孔。在37 ℃、5% CO2孵箱中，分別培養24、48 h后，每孔加入

20 μL MTT，孵育4 h，棄上清，加入150 μL DMSO，輕輕振蕩10 min，待藍紫色結晶物完全溶解后，利用酶標儀，在570 nm波長處檢測各孔OD值計算藥物對細胞增殖的抑制率[15]。

1.4 流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡 收集對數期生長的Hep-2細胞以1×106個/mL細胞數接種于培養瓶中，按照上述細胞培養方法進行培養，并加入終濃度為40 μmol/L BAI，設5個平行樣，同時設置陰性對照組。分別培養24、48 h后，收集細胞，用PBS洗滌2次后，以冷的70%乙醇固定，4 ℃條件下固定過夜，用PI溶液避光染色30 min，利用流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡情況，通過Modifit LT軟件進行分析處理。

1.5 DNA Ladder檢測 取對數生長期的Hep-2細胞，上述細胞培養方法進行培養，并分別加入終濃度為40、80 μmol/L BAI，設5個平行樣，同時設置陰性對照組。分別培養24、48 h后，收集細胞于Eppendorf管中，用PBS洗滌3次后，采用DNA- Ladder抽提試劑盒提取DNA，取5 μL DNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳（75 V，60 min），EB染色后，凝膠成像系統照相。

1.6 統計學處理 用SPSS17.0 統計軟件進行統計學分析，實驗數據用（x±s）表示，采用方差分析進行重復測量的計量資料分析，其他資料用單因素方差分析或t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BAI對Hep-2細胞增殖的抑制率 BAI（10、20、40、80 μmol/L）作用24 h后，各濃度的抑制率分別從（8.23±0.05）%增加到（86.54±0.04）%，差異均有統計學意義（P<0.05）；作用48 h后，各濃度的抑制率分別為（14.52±0.11）%增加到（96.43±0.02）%，差異均有統計學意義（P<0.05）；見表1和圖1。BAI對喉癌Hep-2細胞增殖具有抑制作用，且抑制率呈劑量-時間依賴性（P<0.05）。其中40 μmol/L BAI作用24、48 h，對Hep-2細胞的增殖抑制率達到（53.85±0.07）%和（69.85±0.03）%，為后期研究提供參考濃度和作用時間。

2.2 BAI對Hep-2細胞周期分布及細胞凋亡的影響 流式細胞術結果表明，終濃度為40 μmol/L BAI作用于Hep-2細胞24 h后，S期細胞比例較陰性對照組明顯增多，說明BAI誘導Hep-2細胞阻滯在S期；48 h作用后，也表現出相同的影響趨勢，差異均有統計學意義（P<0.05）。此外，終濃度為40 μmol/L BAI作用24 h后細胞凋亡率較陰性對照組顯著升高；48 h作用后，也表現出相同的影響趨勢，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2和表2。

2.3 BAI對Hep-2細胞凋亡后DNA的影響 陰性對照組僅存在一條50 kb以上的大片段基因組DNA，40、80 μmol/L BAI作用后，可見典型的小片段的DNA梯帶，即DNA Ladder。80 μmol/L作用后的DNA Ladder條帶比40 μmol/L作用后條帶亮度更高（P<0.05）。但是24 h作用后與48 h作用后比較，差異無統計學意義（P>0.05）。說明BAI可以誘導Hep-2細胞核DNA斷裂，形成DNA Ladder，呈劑量依賴性。見圖3。

3 討論

研究結果表明，BAI（10～80 μmol/L）作用于Hep-2細胞后，對細胞增殖的抑制率最高可達（96.43±0.02）%，呈時間-劑量依賴性（P<0.05），這結果與前期所完成研究成果趨勢相同[15]。說明BAI可以抑制喉癌Hep-2細胞的增殖。其中，40 μmol/L BAI作用24 h后，對Hep-2細胞的抑制為（53.85±0.07）%，這為后續研究提供了有效濃度參考。

本研究進一步通過流式細胞術檢測BAI對喉癌Hep-2細胞的誘導凋亡作用及對細胞周期分布的影響。結果表明，終濃度為40 μmol/L BAI，一方面可誘使大量的喉癌Hep-2細胞阻滯在S期。另一方面，可以誘導喉癌細胞凋亡率顯著升高。研究表明，在細胞凋亡晚期，細胞內依賴Ca2+的核酸內切酶被激活，高分子量DNA減少，核內基因組DNA被水解斷裂，斷裂發生在核小體之間，產生長度為180～200 bp及其整倍數的DNA片段（DNA Ladder），這種現象是細胞凋亡的重要標志之一，而壞死細胞不具有此特征。雖然并非所有細胞凋亡均出現該特征，但出現該特征的一定是凋亡細胞。利用這一特征，可以證明存在大量細胞凋亡[16-21]。結合本研究中，BAI作用后可見典型的DNA Ladder，以及上述流式細胞術的結果，說明了BAI可誘導喉癌細胞凋亡，呈時間-劑量依賴性（P<0.01）。

綜上所述，BAI可抑制人喉癌Hep-2細胞增殖；使細胞周期阻滯在S期，誘發Hep-2細胞凋亡率升高；BAI誘使得凋亡晚期細胞的核DNA被剪切為DNA Ladder，進而啟動后續的細胞凋亡信號，誘使人喉癌Hep-2細胞凋亡，達到抗癌作用。這些研究成果是對BAI抗癌特性的突破性認識，拓展了對BAI抗癌機制的研究，并對進一步研究BAI誘導喉癌細胞凋亡的分子機制指明了方向，如與細胞凋亡相關因子的研究。

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（收稿日期：2018-02-07） （本文編輯：張帥）