新生大鼠施萬細胞體外培養的實驗研究

周敏　胡鳴　何松明

[摘要] 目的 通過比較兩種不同的新生大鼠施萬細胞（SCs）原代培養的方法（雙酶消化法與單酶消化法），探索出一種細胞純度更高、獲取時間更短的SCs細胞培養方法。方法 取4～5 d SD乳鼠雙側坐骨神經，分別采用單酶和雙酶消化法，聯合運用半植塊法、差速消化法、差速貼壁法以及抗有絲分裂法原代培養純化SCs。培養SCs 48 h和6 d后倒置顯微鏡觀察兩組細胞形態，7 d后分別進行SCs消化與傳代，細胞計數板計數兩組的SCs總數，傳代48 h后用免疫熒光標記S-100蛋白對兩組細胞進行鑒定，CCK-8測定細胞生長曲線。結果 用等量的神經組織，與單酶消化法比較，雙酶消化法培養的SCs所獲得SCs數目遠高于單酶消化法所獲得細胞數目（2倍以上）。免疫熒光結果顯示，雙酶消化法純度[（95.29±1.71）%]高于單酶消化法[（72.41±2.16）%]（P < 0.05），兩種方法P3代細胞生長曲線差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 在短時間內，用雙酶消化法聯合半植塊法、差速消化法、差速貼壁法以及抗有絲分裂法可獲得足量和高純度的SCs。

[關鍵詞] 施萬細胞；原代培養；雙酶消化法；單酶消化法

[中圖分類號] R329.21 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）05（a）-0014-04

Experimental study on culturing Schwann cells of neonatal rats in vitro

ZHOU Min HU Ming HE Songming HUANG Guotao CHEN Qian HONG Li

Department of Gynecology and Obstetrics， People's Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To explore a culture of SCs method with higher cell purity and shorter time by comparing the two methods including the double-enzyme digestion and single-enzyme digestion of primary culture of Schwann cells （SCs） using the neonatal rats. Methods Bilaterally sciatic nerves were dissected from 4 to 5-day-old neonatal SD rats and double-enzyme digestion method and single-enzyme digestion method which both combined with hemi-explants-culture method， differential digestion method， differential adhesion method， and cytosine arabinoside were used to culture and purify SCs， respectively. The morphology of the SCs was observed under the inverted microscope at 48 hours and 6 days of culture. Then the SCs were digested and passaged after 7 days in culture and counted under the cell counter. The purity of SCs was identified by S-100 immunofluorescence staining. CCK-8 was used to measure the P3 cells growth curve， respectively. Results With the same number of neonatal rats， double-enzyme digestion method acquired SCs at least twice than single-enzyme digestion method. （95.29±1.71）% of S-100 positive SCs cultured were shown by immunofluorescence staining in the double-enzyme digestion method group， and （72.41±2.16）% in the single-enzyme digestion method group （P < 0.05）. There was no difference between the two cultures in the growth curve of P3 cells （P > 0.05）. Conclusion The double-enzyme digestion combined with hemi-explants-culture method， differential digestion method， differential adhesion method， and cytosine arabinoside may obtain sufficient amount of high-purity SCs in a short time and be applied in the further cytological experimental research on peripheral nerve regeneration.

[Key words] Schwann cell； Primary culture； Double-enzyme digestion method； Single-enzyme digestion method

施萬細胞（Schwann cells，SCs）是一類特殊的神經膠質細胞，其包裹著外周神經軸突形成有髓神經纖維的髓鞘。當周圍神經受損后，SCs與神經元之間的信號轉導對神經軸突的生長和維持有重要作用[1-2]。SCs主要通過調節突觸前神經軸突末梢的活動、產生神經營養因子，以及清除軸突、髓鞘碎片，在基底膜形成有效的基板，形成再生的神經元軸突生長的通道，從而促進軸突再生[3-6]。因此，研究周圍神經再生就要求能夠在短時間內高效率提供足量高純度的SCs[7]。盡管當前SCs的原代分離、純化和培養技術趨于成熟，但其獲取細胞過程普遍存在復雜、耗時甚至純度達不到要求等缺點。本文主要結合多種純化方法比較兩種消化方法體外培養SCs的純度、數量及時間，探索出一種更加經濟，便捷高效的原代施萬細胞的分離，純化培養方法，為后續細胞學實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SD鼠嬰（出生4～5 d），由武漢大學人民醫院動物實驗中心提供（NO.42009800002680）。DMEM/F12培養基、D-Hanks液（中國吉諾生物有限公司）；胎牛血清（美國Gemini公司）；兩性霉素、阿糖胞苷（Ara-C）（美國Amresco公司）；Ⅰ型膠原酶、0.25%胰蛋白酶和多聚賴氨酸（PLL）（美國Sigma公司）；兔抗S-100蛋白抗體（美國Abcam公司）；CCK8試劑盒（中國碧云天生物技術研究所）。

1.2 方法

1.2.1 SCs原代培養

選取出生4～5 d的SD鼠嬰12只，冰凍處死，無菌分離坐骨神經后在解剖顯微鏡下剝去外膜，分別用含2.5 μg/mL的兩性霉素的DMEM/F12培養液、含5%雙抗的D-Hanks液和純D-Hanks液浸泡5 min，然后置于配制好的全培養基（含20% FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養基）中，組織剪剪碎至1～2 mm3大小，等體積均分為兩組，離心收集組織塊。第1組為單酶消化培養法組：組織中加入0.25%胰蛋白酶4 mL，置于37℃，5%CO2培養箱中培養30 min，期間每隔10 min取出置于混勻器混勻30 s，然后離心棄上清，再加入0.25%胰蛋白酶4 mL于培養箱中消化60 min，每隔20 min混勻30 s。第2組為雙酶消化培養法組：加入0.2%Ⅰ型膠原酶1 mL和0.25%胰蛋白酶3 mL，置于培養箱內30 min，期間每隔10 min混勻30 s，離心棄上清，再加入0.2%Ⅰ型膠原酶4 mL于培養箱中消化60 min，每隔20 min混勻30 s。消化后兩組均離心棄上清后用全培養基終止消化，再次離心棄上清，各加入全培養基3 mL，分別均勻接種于預鋪有PLL的60 mm3培養皿。

1.2.2 SCs純化和傳代

差速貼壁去除成纖維細胞，在細胞培養30 min后吸出上清液體轉入預鋪PLL新的培養皿，培養箱中培養24 h，然后將兩組均更換為含10 μmol/L Ara-C的全培養基，24 h后更換為新鮮全培養基，3 d后換液。待細胞長滿80%，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶差速消化，待部分細胞變圓后，終止消化，離心棄上清液，加入全培養基吹打混勻后接種于預鋪PLL的培養皿中，差速貼壁純化2次，計數后將上清液置于T25培養瓶和鋪有爬片的六孔板中于培養箱培養。

1.2.2 SCs的鑒定

1.2.2.1 SCs形態觀察 每天定點在普通倒置顯微鏡下觀察細胞形態，并拍照記錄。

1.2.2.2 S-100免疫熒光染色鑒定 傳代培養48 h后，取出爬片，PBS浸洗后，經過4%多聚甲醛固定，0.5% Triton-X100透化，山羊血清室溫封閉30 min，anti-S-100一抗（1︰500）4℃孵育過夜，Alexa Fluor 594熒光二抗（1︰2000）濕盒避光37℃孵育1 h，DAPI染核5 min，封片，使用熒光顯微鏡觀察并采集圖像。

1.2.3 CCK8法檢測SCs生長

將兩組第3代（P3）的SCs細胞懸液等量分別接種于96孔板中，設置7組，每組5個復孔，培養箱孵育24 h，待細胞貼壁以后任取一組加入10 μL CCK8試劑，37℃孵育1 h后，酶標儀測定450 nm波長的吸光度，并做好記錄，然后每隔24 h任取剩余組中的一組細胞，測定吸光度，取均值后繪制SCs增殖曲線。

1.3 統計學方法

采用Prism graphpad 5.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SCs倒置顯微鏡觀察

雙酶法培養48 h后，即可觀察到少量細小組織塊及細胞爬出，在普通顯微鏡視野下可以看到爬出來的細胞中多數細胞體積較小，胞體邊緣強透光性，呈現亮暈特征，且多數有兩個長突起的梭形樣細胞，有的細胞甚至有3個突起呈三角形樣，這類細胞即為SCs。而剩下一些形狀不規則、體積較大且透光性差，沒有亮暈的細胞為成纖維細胞。單酶法培養48 h后可見大塊組織塊及少數細胞呈輻射狀爬出，且成纖維細胞數目比雙酶法較高。雙酶法細胞增殖速度比較單酶法速度更快。接種6 d后，雙酶組較單酶消化組長得更快，在25 cm培養瓶中，分別長滿80%和40%（圖1）。

2.2提取細胞數

兩組細胞培養7 d后，分別消化后計數，單酶法可獲得（0.69±0.12）×106個細胞，雙酶法可獲得（1.67±0.03）×106個細胞，兩種培養方法比較，差異有統計學意義（P < 0.05）。

2.3 P0代SCs的獲得時間

雙酶法和單酶法培養SCs的收獲時間分別是（8.0±0.5）、（12.0±0.5）d，兩種培養方法比較差異有統計學意義（P < 0.05），雙酶法收獲SCs時間增快。

2.4 S-100免疫熒光鑒定

所有細胞核發出藍色熒光，其中胞漿呈紅色的為S-100陽性細胞，即SCs，部分細胞核大，顏色淺，且胞漿無紅色熒光者為雜細胞。通過對視野細胞計數可以發現雙酶法紅色熒光比例較單酶法多，經計數后雙酶法細SCs純度可達（95.29±1.71）%，單酶法細胞純度為（72.41±2.16）%，兩種培養方法比較差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖2（封三）。

2.5 細胞生長特征

通過CCK8方法分析兩種方法下P3SCs生長曲線，結果顯示兩種方法比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。即：兩組細胞在接種同樣的數量前提下，其生長曲線相似。說明兩種酶消化對細胞損傷無差異，均不影響細胞生長活力。見圖3。

3 討論

分離培養原代SCs常選擇SD大鼠鼠嬰的雙側坐骨神經，新生2 d內的鼠嬰來源的周圍神經較為柔嫩、細小、易斷且與周圍組織難以分離，而來源6 d后的以及成年的SD大鼠的SCs存在分裂增殖能力較弱的缺點且伴隨著較多的雜細胞[8]。鑒于取材便捷和分離純化后細胞的生長活力，本實驗取材于出生4～5 d的SD鼠嬰[9]。

目前關于SCs培養方法有很多，主要包括了酶消化法[10]，經典植塊法[11]和免疫選擇法[12]，但是上述培養方法均有缺陷。經典植塊法通過反復貼壁獲得SCs耗時較長且培養過程中伴有SCs分裂增殖能力的下降；單純的酶消化法很難獲得預期的純度的SCs，容易摻雜其他細胞污染，如成纖維細胞；免疫選擇法存在成本高且培養效率低下的缺點，因此難以達到研究需求的細胞量[13]。本實驗基于大多研究人員報道的實驗方法，用同樣多的鼠嬰，在細胞數量與純度、培養時間上比較了半植塊單酶消化法和半植塊雙酶消化法。結果顯示在數量上雙酶法有著比單酶法更好的優勢，極大縮短了獲得第一代細胞的時間，主要原因可能是利用胰蛋白酶消化去除組織中的間質，分散組織使細胞單層排列，結合Ⅰ型膠原酶消化成纖維細胞相對于SCs更為敏感，且對SCs細胞損傷較小的特性。雙酶（胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶）法能夠在保證細胞活力的前提下，將組織中成纖維細胞大量消化下來從而更加有利于SCs爬出，因此在數量上會比單酶法要有優勢，有效的改善了SCs體外培養所獲P0時間長，獲得的SCs量少的不足且細胞能夠多次傳代后仍保持良好的增殖能力。此外，在體外接種同樣數量比較P3代細胞增殖曲線發現，兩種方法生長曲線基本重合，表明兩種方法對細胞的損傷無差異，即SCs有著相似的活力，以上證據表明在同等損傷條件下，雙酶法比單酶法能夠更快獲得P0代細胞，極大縮短獲取預期純度和數量的細胞的時間。

此外，為了分離純度更高的具有高活力的SCs，除酶消化法結合半植塊法之外，本研究還結合了其他常用的細胞純化培養技術方法：①差速消化法[14]。差速消化法基于成纖維細胞比SCs對胰蛋白酶更耐受的特點進行分離純化。SCs主要依賴突起黏附在皿底，而成纖維整個胞體都可以緊貼瓶底，因此對胰蛋白酶更加耐受，較SCs更難消化下來。因此只需要在傳代時候快速胰酶消化下SCs，留下成纖維細胞在皿底就可以達到純化目的[15]。②差速貼壁法[16]。差速貼壁法的原理是基于成纖維細胞比SCs對PLL黏附力較強的特點來進行分離純化，細胞接種半小時后，將上清收集離心培養，為了最大限度減少SCs損失，可以采用雙向差速貼壁法[17]。③Ara-C是一種有絲分裂抑制劑，能夠對處于S期增殖的細胞起到特異抑制作用，其主要原理是能夠阻止和干擾DNA的合成和復制過程[18]。因此Ara-C可以特異殺傷增殖較快的成纖維細胞從而達到純化目的。由于Ara-C毒性大，長時間培養會導致SCs的活力受到影響，因此作用24 h后應更換培養基[19]。此外，有些研究報道為了去除雜細胞的污染，如成纖維細胞，利用相應的抗體來消除，但帶來的問題也很明顯，由于抗體的非特異性損傷會影響SCs后續生長活力，且多數抗體的成本較高，不能重復利用，因此想要獲得大量的SCs顯然是不可取的[20]。

綜上所述，本研究采用的半植塊雙酶消化法培養SCs優于當前比較普遍的單酶消化方法。相比較于單酶法，雙酶法能夠在更短的時間內獲得更多的高純度的SCs，極大地縮短了細胞培養周期，且培養成本與單酶法相差無幾。總的來說，雙酶法完全可以替代當前的單酶法，是一種方便、快捷、高效的細胞培養方法，為后續細胞實驗提供保障。

[參考文獻]

[1] Chen WA，Luo TD，Barnwell JC，et al. Age-Dependent Schwann Cell Phenotype Regulation Following Peripheral Nerve Injury [J]. J Hand Surg Asian Pac Vol，2017，22（4）：464-471.

[2] Lopez-Verrilli MA，Picou F，Court FA. Schwann cell-derived exosomes enhance axonal regeneration in the peripheral nervous system [J]. Glia，2013，61（11）：1795-1806.

[3] Mclean NA，Verge VM. Dynamic impact of brief electrical nerve stimulation on the neural immune axis—polarization of macrophages toward a pro-repair phenotype in demyelinated peripheral nerve [J]. Glia，2016，64（9）：1546-1561.

[4] Chen TJ，Fr？hlich N，Kula B，et al. Glutamate activates AMPA receptor conductance in the developing Schwann cells of the mammalian peripheral nerves [J]. J Neurosci，2017，37（49）：11 818-11 834.

[5] Gomez-Sanchez JA，Pilch KS，van der Lans M，et al. After Nerve Injury，Lineage Tracing Shows That Myelin and Remak Schwann Cells Elongate Extensively and Branch to Form Repair Schwann Cells，Which Shorten Radically on Remyelination [J]. J Neurosci，2017，37（37）：9086-9099.

[6] Belin S，Zuloaga KL，Poitelon Y. Influence of Mechanical Stimuli on Schwann Cell Biology [J]. Front Cell Neurosci，2017，11：347.

[7] Wang G，Ma Z，Cao L，et al. A novel method for obtaining highly enriched Schwann cell populations from mature monkey nerves based on in vitro pre-degeneration [J]. Mol Med Rep，2017，16（5）：6600-6607.

[8] Keilhoff G，Fansa H，Sehneider W，et al. In vivo predegeneration of peripheral nerves：an effect technique to obtain activated Schwann cells for nerves conduits [J]. J Neurosci Methods，1999，89（1）：17-24.

[9] Fansa H，Keilhoff G，Frerichs O，et al. Effect of pre-degeneration of peripheral nerves on plasticity of cultivated Schwann cells and their cell number in vitro [J]. Handchir Mikrochir Plast Chir，1999，31（6）：367-372.

[10] Komiyama T，Nakao Y，Toyama Y，et al. A novel technique to isolate adult Schwann cells for an artifi cial nerve conduit [J]. J Neurosci Methods，2003，122（2）：195-200.

[11] Askanas V，Engel WK，Dalakas MC，et al. Human schwann cells in tissue culture：histochemical and ultrast ructural studies [J]. Arch Neurol，1980，37（6）：329-337.

[12] 李陳.施萬細胞培養與純化研究進展[J].醫學綜述，2014， 20（8）：1371-1373.

[13] 劉頔，梁曉春，張宏.改良消化復合植塊法培養新生大鼠雪旺細胞[J].中國醫學科學院學報，2016，38（4）：388-392.

[14] 韓巖，湯朝伍，王劍波，等.利用Geneticin純化雪旺細胞的實驗研究[J].中華顯微外科雜志，1997，20（4）：277-280.

[15] Wei Y，Zhou J，Zheng Z，et al. An improved method for isolating Schwann cells from postnatal rat sciatic nerves [J]. Cell Tissue Res，2009，337（3）：361-369.

[16] 漆白文，喻愛喜，張功禮，等.新生大鼠雪旺細胞的體外培養和純化[J].鄖陽醫學院學報，2006，25（4）：207-208.

[17] Wu W，Jin YQ，Kretlow JD，et al. Purification of Schwann cells from adult rats by differential detachment [J]. Biotechnol Lett，2009，31（11）：1703-1708.

[18] Calderon-Martinez D，Garavito Z，Spinel C，et al. Schwann cell-enriched cultures from adult human peripheral nerve：a technique combining short enzymatic dissociation and treatment with cytosine arabinoside（Ara-C） [J]. J Neurosci Methods，2002，114（1）：1-8.

[19] Anand U，Otto WR，Bountra C，et al. Cytosine arabinoside affects the heat and capsaicin receptor TRPV1 localisation and sensitivity in human sensory neurons [J]. J Neurooncol，2008，89（1）：1-7.

[20] Kaewkhaw R，Scutt AM，Haycock JW. Integrated culture and purification of rat Schwann cells from freshly isolated adult tissue [J]. Nat Protoc，2012，7（11）：1996-2004.

（收稿日期：2018-01-12 本文編輯：任 念）