薄層色譜法與高效液相色譜法對18F-FDG放射化學純度測定的比較研究

雷震山 陳立光 張勤國 梁明泉 鄧慶榮

正電子發射斷層顯像(positron emission tomography, PET)是一種先進的核醫學影像技術, 而計算機斷層攝影術(computed tomography, CT)是一種X線斷層成像技術, 并已在臨床廣泛應用。PET/CT是二者的有機結合, 是近年發展起來的先進核醫學技術, 有廣闊的應用前景。PET/CT通過影像記錄細胞增殖的標記分子, 從而預測腫瘤和心臟、腦部疾病的個性化治療反應［1-3］。18F-FDG是目前臨床上常用的正電子放射性藥物, 可用于腫瘤、心肌存活以及中樞神經系統疾病的診斷。18F-FDG大部分由醫院自行制備, 經過在國內近20年的臨床試用, 2015年版《中國藥典(二部)》［4］開始將其收載為18F-FDG。隨著我國PET/CT掃描儀普及以及回旋加速器藥物生產系統投入使用,18F-FDG的制備、藥品質量控制和用藥安全越來越受到國家藥監部門的重視。作為正電子類放射性核素標記的放射性藥物, 在所用質量控制指標中18F-FDG的放化純度是最重要的指標, 其放化純度的高低嚴重影響著PET/CT掃描的圖像質量, 從而影響影像醫學專家的診斷。《中國藥典(四部)》［5］明確規定18F-FDG的放化純度＞90%,檢測方法參照TLC(通則0502)試驗。文獻中常用TLC、HPLC進行檢測［6-10］, 本研究擬探討一種快速準TLC方法用于檢測放化純度, 并對比HPLC、TLC 方法在檢測18F-FDG放化純度的差異。報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 Eclipse RD 型Cyclotron 回旋加速器(西門子公司)；藥物生產系統(發明專利申請號：20171068609.4)；CRC-15R 型活度計(美國CAPINTEC公司)；HPLC(Agilent 1200 , Agilent公司, 配備Binary 雙泵, Variable Wavelength檢測器, 7725i帶傳感器進樣器), 分離柱為高效糖柱(High Performance Carbohydrate Column, 60 A, 4 μm)；PET metabolite Dual BGO型流動放射性活度檢測器(Bioscan公司)；MiniGita薄層色層(TLC)儀(Raytest 公司)。

1.1.2 試劑 H218O(豐度95%, ABX公司)；2-三氟甲基磺酰基-β-D甘露糖(三氟甘露糖, Sigma-Aldrich公司)；Kryptofix2.2.2(K2.2.2), 無水乙腈(Sigma-Aldrich公司)；硅膠板(Whatman PE Silg/UV, Whatman公司 )；QMA 柱、Alumin-N 柱、C-18柱(均為Waters公司)；AG50樹脂和AG11A8樹脂(50-100目, Bio-Rad公司)。HPLC級甲醇、乙醇、乙腈(均為德國Merk公司)；層析紙(英國Whatman)；硅膠紙(上海造紙研究所)。

1.2 方法

1.2.118F-FDG的合成18F-FDG的制備包括標準的六個步驟。①首先是18F-負離子的產生, 從O-18富氧水開始, 通過p-n核反應產生18F-負離子。②俘獲和釋放18F-負離子。③通過乙腈和水的共沸原理移除反應體系中的水分形成反應活性18F-負離子。④反應活性放射性18F-負離子和2-三氟甲基磺酰基-β-D甘露糖發生親核反應, 產生18F-負離子輻射標記的甘露糖三氟磺酸酯。⑤水解移除乙酰基保護基團。⑥純化產物, 這一步移除各種中間產物并作無菌、無熱源等純化處理。

1.2.218F-FDG產品的TLC分析 按照《中國藥典(二部)》2015版方法進行。取Whatman PE Silg/UV硅膠板(200 mm×200 mm)裁成高100 mm、寬10 mm, 并用鉛筆在一側輕輕畫上距離底端距離為10 mm 的記號線, 在記號線的中央做標識作為點樣標識點；以乙腈-水(95∶5)為展開劑展開, 將晾干后的硅膠G板放置于MiniGita薄層色譜儀中, 將點樣標識點所在的刻度線和薄層色譜儀的0刻度線重合。啟動MiniGita TLC軟件對硅膠G板的放射性分布進行檢測, 掃描時間為10 min, 能量范圍：450～750 keV；采用GINA軟件分析圖譜的Rf值和峰面積, 軟件自動計算出18F-FDG放化純度。

1.2.318F-FDG產品的HPLC分析 HPLC選擇高效糖柱作為分離柱；流動相為V(乙腈)：V(水)=85∶15, 手動調節流動相流速為1.0 ml/min, 分析時間設定為15 min。分析時使用WINFLOW軟件, 設置啟動方式為“外部手動”；測量樣品池體積為30 μl；選擇核素能峰為511 keV；開啟一個高能放射性測量通道及一個非放射性測量通道, 顯示屏會同時出現兩個侯命的測量坐標系。進樣后扳動進樣閥。兩個測量系統開始工作, 分別采集經過高效糖柱分離后放射性及非放射性信號, 顯示屏上同時觀察兩個峰譜。

2 結果

2.1 TLC分析18F-FDG產品的放化純度 TLC的支持體為硅膠G薄層板, 以乙腈-水(95∶5)為展開劑, 展開完畢后用TLC掃描, 測定放射性分布,18F-FDG的Rf=0.435, 符合2015版藥典標準0.4～0.6的范圍, 測得其放化純度為99.82%,符合2015版藥典規定放化純度≥90%的標準。見圖1。

圖1 18F-FDG的TLC分析圖

2.2 HPLC法測定18F-FDG放化純度

2.2.1 乙睛濃度和流速對18F與18F-FDG保留時間的影響手動設定流動相流速為1.0 ml/min, 改變流動相的濃度, 對18F與18F-FDG在分離柱的保留時間進行分析, 確定50%和85%的乙腈能有效分離組份。因50%的乙腈濃度在分離柱上的阻力較大, 故選擇85%的乙腈作為流動相, 用85%乙腈作流動相時18F-FDG的放化純度分析時間在15 min左右。通過增加流速進行對比分析, 隨著流動相的加快,18F與18F-FDG的保留時間均減少, 均能有效地分離組分。

2.2.2 HPLC對18F-FDG放化純度的分析 流動相為85%的乙睛, 流速為1 ml/min。tR=6.6 min處有一放射性峰, 為游離的18F。見圖2。18F與18F-FDG混合后的HPLC譜上有2個放射性峰, 第1個為游離的18F, tR=6.5 min, 第2個峰為產品18F-FDG, tR=9.2 min。用計算機自動積分計算,18F-FDG的放化純度＞98%,18F放射性峰與單獨進樣的18F的保留時間微少的區別。見圖3。其原因可能是進樣樣品中不同組份的存在, 影響了化合物在柱子上的分離系數, 從而影響了保留時間。在經過多批次的檢測試驗表明, 用HPLC方法分析18F-FDG放化純度批間穩定性良好,18F與18F-FDG的保留時間不變。

圖2 18F的HPLC分析圖

3 小結

①采用硅膠G薄層板作為TLC的支持體, 以乙腈-水(95∶5)為展開劑, TLC可有效測定18F-FDG的放化純度。18F-FDG的Rf=0.435, 符合2015版藥典標準0.4～0.6的范圍,測得其放化純度為99.82%, 符合2015版藥典規定放化純度≥90%的標準。②采用V(乙腈)：V(水)=85∶15作為HPLC流動相, 高效糖柱為分離柱, 流速為1.0 ml/min, HPLC可有效測定18F-FDG放射化學純度, 測得其放化純度＞98%, 符合2015版藥典規定放化純度≥90%的標準。時間約15 min左右。

總之, TLC和HPLC兩種方法都能有效的測定18F-FDG的放化純度, 而TLC 法方法簡便, 適用于常規檢驗。

圖3 18F與18F-FDG的HPLC分析圖