豆粕替代魚粉對點帶石斑魚生長、消化和抗氧化能力的影響

安貿麟， 范 澤， 王慶奎， 孫金輝， 徐大為， 郭永軍， 程鎮燕

(天津農學院水產學院/天津市水產生態及養殖重點試驗室，天津西青 300384)

點帶石斑魚(Epinepheluscoioiaes)蛋白質含量高、脂肪含量低，不僅包含人體多種代謝所必需的氨基酸，而且富含多種無機鹽和鐵、鈣、磷這些微量元素以及各種維生素。近年來，石斑魚的養殖已經成為我國東南沿海，以及臺灣東南部重要的海水養殖的水產品之一。但隨養殖規模的日益擴大，對魚粉的需求量也不斷增大，而全球魚粉的年產量卻日趨下降，其價格一直處在高位，使飼料成本居高不下[1]。因此，尋找到節約飼料魚粉用量的適宜途徑成為點帶石斑魚配合飼料開發的研究熱點及難點。

目前，節約飼料魚粉用量的主要途徑均是在尋找適宜的替代蛋白源及利用脂肪或糖類對蛋白的節約作用等基礎上進行思考與探索，如在翹嘴鲌(Culteralburnus)[2]、齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[3]和鯉(Cyprinuscarpio)[4-6]等均有這些方面工作的報道。開發植物蛋白源(如豆粕[2-3]、桑葉發酵蛋白[7]、玉米蛋白[8]等優質植物蛋白源)替代魚粉的研究則是此類研究中較為活躍的部分，而其中集蛋白含量較高、數量體積龐大且經濟實惠等優勢于一身的豆粕則被認為是代替魚粉的第一選擇。但由于豆粕其本身含有例如胰蛋白酶抑制因子、大豆凝集素等抗營養因子，影響了動物腸道的微生態環境，營養物質的消化和吸收受到妨礙，再加上適口性較差，致使豆粕的使用在水產動物飼料中受到限制[9]。據報道，飼料中大豆分離蛋白替代40%的魚粉時，虹鱒的生長及飼料轉化率達到最佳[10]；豆粕替代16%的魚粉時牙鲆生長性能為適佳[11]。因此，尋找到在特定漁用飼料中豆粕替代魚粉的適宜比例則成為此類研究的重點。目前，尚未見到有關植物蛋白質原料替代魚粉在點帶石斑魚實用飼料中效果的研究報道。因此，本試驗通過研究豆粕替代魚粉對點帶石斑魚生長性能、消化能力及抗氧化能力的影響，評價豆粕替代魚粉在點帶石斑魚實用飼料中的效果，旨在為優化點帶石斑魚人工配合飼料及合理利用大豆蛋白源提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

配制6種蛋白質含量為48%、脂肪含量為12%、能量為19 MJ/kg的等氮等能飼料，對照組D0含60%蛋白質的魚粉，試驗組D1～D5組分別用豆粕代替10%、20%、30%、40%、50%的魚粉蛋白，試驗原料預混料和魚油除外，用電動粉碎機粉碎，過60目網篩，經購自章丘市華祥顆粒機械有限公司的“華祥”牌SKJ-120型平模飼料顆粒機制成直徑為2 mm的顆粒飼料，室溫下風干，裝入自封袋，-20 ℃保存備用，飼料配方和化學組成見表1。

1.2 試驗魚及飼養管理

試驗魚為天津市海發珍品實業發展有限公司提供的同一批魚種，試驗前先用基礎飼料馴化7 d，后選取體質健壯、規格一致[平均體質量(84±2.5)g/尾]的點帶石斑魚，放入藍色養殖箱(80 cm×40 cm×42 cm)中，每箱放養40尾。飼養試驗進行10周，試驗期間每天飽食投喂2次(09：00和15：30)，每天早上清除箱內糞便，并換水，每天換水量為總水量的 1/3。養殖試驗期間水體溫度為(26±1) ℃，溶解氧濃度為 8.0～10.0 mg/L，pH值為7.5～7.7。

表1 魚飼料組成和營養水平(干物質基礎)

注：a.1 kg預混料組成如下：復合維生素：維生素B121.7 g、維生素B26.8 g、泛酸鈣 16.9 g、煙酰胺 25.4 g、維生素B61.7 g、葉酸 0.5 g、肌醇67.7 g、包膜維生素C 3.4 g、氯化膽堿169.3 g、維生素K 1.4 g、維生素E 3.4 g、維生素A 0.7 g、生物素0.17 g。復合礦物質：乳酸鈣 221.5 g、K2PO4161.9 g、CaHPO4·2H2O 91.4 g、MgSO4·7H2O 89.4g、Na2HPO4·2H2O 59.1g、檸檬酸鐵 20.1 g、ZnSO4·7H2O 2 g、CoCl2·6H2O 0.7 g、MnSO4·H2O 0.5 g、KI 0.1 g、CuSO4·5H2O 54.2 g、Na2O3Se 0.03g。b.1 kg混合氨基酸組成如下：異亮氨酸 82.3g、亮氨酸 0.25 g、賴氨酸 0.5 g、苯丙氨酸 0.04 g、蘇氨酸 132.9 g、纈氨酸 126.6 g、蛋氨酸 158.2 g。

1.3 樣本采集

養殖試驗結束時，試驗魚禁食24 h，從每個養殖箱中隨機取15尾魚，測定魚體質量、體長和全長，采取尾部靜脈抽血方法，每2尾魚的血液為1個樣本，注入2 mL的離心管中，在 4 ℃ 下3 500 r/min離心30 min，取上層血清備用，后于冰盤上解剖，取肝胰臟、前腸、中腸及后腸，迅速轉入-80 ℃低溫冰箱內保存，以用于抗氧化酶活力及消化酶活力的測定。

1.3 試驗方法

1.3.1 生長指標計算 于試驗結束后饑餓24 h稱量魚體質量計算增質量率、飼料效率、成活率等：

體增質量(WG)=(末均質量-初均質量)/初均質量×100%；特定生長率(SGR)=[ln(末均質量)-ln(初均質量)]/天數×100%；

飼料轉化效率(FCR)=飼料干質量/增質量×100%；

蛋白質效率(PER)=增質量/蛋白質投喂量×100%；

肥滿度(CF)=體質量/體長×100%。

1.3.2 粗酶液的制備 肝胰臟、前腸、中腸及后腸在冰生理鹽水中漂洗，除去血液，用濾紙拭干，用移液管移入9倍于組織塊質量的預冷勻漿介質(0.85%生理鹽水)，在勻漿器中進行勻漿，在4 ℃下4 500 r/min離心15 min，取上層清液備用。

1.3.3 生化指標檢測 消化酶活力檢測均采用商業試劑盒(南京建成生物工程研究所)，每個樣品每種酶活力均重復測定3次；蛋白酶活力采用福林酚法測定；脂肪酶活力的測定采用比濁法；淀粉酶采用碘——淀粉比色法進行測定。采用商業試劑盒(南京建成生物工程研究所)對血清及組織中還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和過氧化氫酶(CAT)活力及總抗氧化能力(T-AOC)進行測定。其中GSH含量、SOD活力及T-AOC采用Thermofisher-4MK2型微孔讀板機測定，其余指標采用UVmini-1240型紫外分光光度計測定。

1.4 數據統計

所有數據均用Excel 2007及SPSS 19進行分析處理。利用Excel軟件制作各指標的標準曲線，并利用標準曲線計算得出各樣品中對應指標的活性含量。所有數據均以“平均值±標準差”表示，并利用SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若差異達到顯著水平(P<0.05)，則進行Duncan’s法多重比較。

2 結果與分析

2.1 豆粕替代魚粉對點帶石斑魚生長性能的影響

由表2可知，隨著替代水平的提高，平均末體質量、增質量率、特定生長率、蛋白質效率呈現明顯的先上升后下降的趨勢(P<0.05)，其中，平均末體質量在10%～20%替代組中差異不顯著，但均顯著高于其他處理組；20%替代組的增質量率、特定生長率、蛋白質效率均顯著高于其他處理組(P<0.05)，其余處理組之間差異不顯著。飼料系數隨著替代水平的提高呈明顯先下降后上升的趨勢(P<0.05)，其中飼料系數在10%～20%替代組中差異不顯著(P>0.05)，但顯著低于其他處理組(P<0.05)。肥滿度隨替代水平提高顯著上升(P<0.05)，其中50%替代組與30%、40%替代組無顯著差異，但顯著高于其他處理組(P<0.05)。

表2 飼料中豆粕替代魚粉比例對點帶石斑魚生長性能的影響

注：同列數據后不同小寫字母表示顯示顯著差異(P<0.05)。下表同。

2.2 豆粕替代魚粉對石斑魚腸道消化酶活性影響

2.2.1 豆粕替代魚粉對石斑魚腸道蛋白酶活性的影響 由表3可知，前腸蛋白酶活性隨著替代水平提高，先下降后升高，其中對照組D0(0%)與10%、40%替代組無顯著差異，但顯著高于其他對照組(P<0.05)。在中腸和后腸中蛋白酶活性隨豆粕替代水平提高先升高后降低，其中中腸蛋白酶活性在40%替代組中顯著高于對照組和10%替代組(P<0.05)，但與其他處理組無顯著差異；在后腸中40%替代組蛋白酶活性顯著高于對照組和30%替代組(P<0.05)，但與其他對照組無顯著差異(P>0.05)。

表3 豆粕替代魚粉對點帶石斑魚腸道蛋白酶活性

2.2.2 豆粕替代魚粉對石斑魚腸道淀粉酶活性的影響 由表4可知，投喂不同豆粕替代水平的飼料后，各組織中淀粉酶活性均值有一定波動。在前腸中20%組淀粉酶活性最高，顯著高于對照組和30%替代組(P<0.05)，與其他各組之間差異不顯著。在中腸中40%與50%替代組無顯著差異，但顯著低于其他處理組(P<0.05)。在后腸中50%替代組淀粉酶活性與10%替代組無顯著差異，但明顯高于其他處理組。

2.2.3 豆粕替代魚粉對石斑魚腸道脂肪酶活性的影響 由表5可知，投喂不同豆粕替代水平飼料后，腸道中脂肪酶活性先升高后降低。在前腸、中腸、后腸中20%替代組明顯高于其他處理組(P<0.05)。

2.3 豆粕替代魚粉對石斑魚抗氧化指標影響

由表6可知，隨著替代水平的提高，血清超氧化物歧化酶(SOD) 活性顯著降低， 最高值出現在對照組， 顯著高于50%替代組(P<0.05)，與其他處理組之間差異不顯著；在肝臟中D2(20%)組SOD活性最高且與其他5組存在顯著差異(P<0.05)。過氧化氫酶活性隨豆粕替代量增加先增強后減弱，肝臟中過氧化氫酶活性最高為D2組且與其余5組存在顯著差異(P<0.05)；而血清中過氧化氫酶活性最高為D4組，與其余5組差異不顯著(P>0.05)。在血清中，丙二醛含量隨豆粕替代量的變化并無明顯變化，豆粕替代魚粉對丙二醛影響并不顯著(P>0.05)；在肝臟中，D2組丙二醛含量最高，且與其他幾組差異明顯(P<0.05)。還原型谷胱甘肽活性均值有一定的波動，在血清中D1組GSH表達量最高但與其他5組無顯著差異(P>0.05)；在肝臟中D4組GSH含量最高，與其余5組存在顯著差異(P<0.05)。總抗氧化能力均值有一定的波動，在血清中 T-AOC最高組為D3但與其余5組無顯著差異(P>0.05)；T-AOC在肝臟中最高位D2組，與其他5組存在明顯差異(P<0.05)。

表4 豆粕替代魚粉對點帶石斑魚腸道淀粉酶活性

表5 豆粕替代魚粉對點帶石斑魚腸道脂肪酶活性

表6 豆粕替代魚粉對石斑魚抗氧化指標影響

3 討論

3.1 飼料中豆粕替代魚粉比例對點帶石斑魚生長性能的影響

蛋白質是魚類生長過程中的關鍵因素，是構成動物機體的成分，同時還為水產動物提供能量。目前，在水產動物飼料中植物蛋白源部分替代魚粉成為研究的熱點。已有相關研究報道，當膨化豆粕替代魚粉蛋白比例為60%時，不會對虹鱒魚生長指標產生影響[12]。在5%豆粕替代魚粉用量的1/3時，不影響奧尼羅非魚幼魚及魚種生長性能，但當替代量達2/3時，幼魚生長顯著降低[13]。本試驗中，飼料中豆粕替代魚粉對點帶石斑魚增質量率、蛋白質效率和特定生長率有顯著影響，且隨豆粕的替代量的增大呈先增后減的趨勢，在豆粕替代水平為20%的D2組，增質量率、特定生長率和蛋白質效率均為最大值，且餌料系數降為最低。而當替代水平再上升時，增質量率、特定生長率和蛋白質效率都隨之下降，而餌料系數卻隨之上升，這與鄒文超等的研究結果[14]相符，其研究結果表明斜帶石斑魚飼料中豆粕替代魚粉蛋白的比例不宜超過30%，當豆粕替代40%魚粉蛋白時，斜帶石斑魚生長性能下降。從上述2個試驗中可以發現，在石斑魚飼料中豆粕替代魚粉比例適宜時，不但不會影響其生長，反而會在一定程度上增強其飼料利用能力，進而促進生長；但替代比例過高，豆粕存在的多種抗營養因子、敗風味物質可能造成飼料適口性不佳，使得飼料中較高的豆粕比例降低了魚類對飼料蛋白質的消化能力，并且其氨基酸利用效率較低，尤其是蛋氨酸、賴氨酸利用率不足，影響水生動物對飼料的利用，抑制生長。而楊嚴鷗等指出在不影響黃顙魚生長性能的前提下，其飼料中豆粕替代魚粉蛋白含量最高為30%，但過量替代時，黃顙魚的生長指標同樣會降低，上述替代量的差異可能是由于試驗魚種類不同，養殖條件存在差異等原因[15]。

肥滿度被視為魚類生物學研究中衡量生長和攝食強度等健康狀況的1個指標，其變化也預示著魚體對于飼料營養的利用情況。本研究發現，肥滿度隨替代水平提高顯著上升，而劉汝鵬等及王桂芹等對翹嘴鲌的研究發現豆粕替代魚粉水平未對肥滿度產生顯著性影響，但亦成升高趨勢[16-17]。綜合上述生長指標分析發現，適宜豆粕替代魚粉比例能夠增強魚的攝食強度，進而使魚體獲得更好的生長及肥滿度；但替代比例過高，隨肥滿度仍呈升高趨勢，但魚體生長性能出現下降，表明從表觀來看魚體獲得良好的肥滿度，并不是因為飼料利用能力的增強，而可能是因為飼料蛋白質或糖轉變為脂肪或者糖原蓄積在肝臟或內臟中等原因造成的，其具體的影響機制仍需進一步研究。

3.2 飼料中豆粕替代魚粉比例對點帶石斑魚消化酶活性的影響

在豆粕替代魚粉的過程中，胰蛋白酶抑制因子、皂角苷、大豆凝集素等豆粕自身含有的抗營養因子均會成為抑制水產動物蛋白酶分泌及活性的重要因素，如Sveier在對大西洋鮭魚的研究中發現胰蛋白酶抑制因子既可以通過在腸道中與蛋白酶直接結合的方式降低蛋白酶活性，又可以通過影響肝胰臟發育抑制蛋白酶的合成與分泌[18]。在腸道中，前腸作為其中主要消化蛋白的部分，本研究中發現豆粕替代水平的升高會降低點帶石斑魚前腸蛋白酶活性，而中腸及后腸蛋白酶活性則隨之呈顯著上升趨勢，但腸道蛋白酶活性總體仍呈下降趨勢，推測魚體會通過調節腸道中不同部位的蛋白酶合成及分泌來適應飼料中蛋白源的變化。這與鄒文超對斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)的研究結果[19]相似。此外，本試驗發現蛋白源變化在引起蛋白酶活性變化的同時，也會引起使其他消化酶活性產生相應變化，如當豆粕替代魚粉蛋白比例達到20%時會顯著提高前腸中淀粉酶活性，揭示豆粕替代比例的升高會增加飼料中的淀粉含量，進而誘導魚體內淀粉酶的合成。而錢曦等在對翹嘴鲌(ErythroculterilishaeformisBleeker)的研究中發現，腸道淀粉酶活性并不因豆粕替代魚粉比例的提高而有顯著性變化[20]，究其主要原因是魚種的差異，相較于肉食性的點帶石斑魚，雜食性的翹嘴鲌體內的淀粉酶活性較高[21]，能夠更好地適應飼料中淀粉含量的增加。此外，當豆粕替代魚粉比例達到20%時也會顯著提高與前腸、中腸及后腸的脂肪酶活性，其具體影響機制還有待進一步研究。

3.3 飼料中豆粕替代魚粉比例對點帶石斑魚抗氧化能力的影響

魚類體內抗氧化酶的缺乏會導致體內原有的自由基代謝平衡遭到破壞；正常情況下，體內產生的自由基即活性氧可被非酶性或酶性抗氧化系統清除掉，其中SOD和GSH-Px是魚體內的主要抗氧化酶，SOD能催化超氧陰離子產生歧化反應，清除超氧陰離子，保護細胞免受損傷。GSH-Px能特異地催化還原型谷胱甘肽(GSH)對H2O2的還原反應，保護細胞膜結構和功能的完整性[22-23]。在本試驗的豆粕替代梯度中，各替代梯度的血清的抗氧化能力指標基本沒有明顯變化，而肝臟中GSH值先減后增，SOD與MDA值則是先增后減。綜合來看，豆粕替代20%魚粉對點帶石斑魚的抗氧化能力比較有利。上述研究表明，在點帶石斑魚飼料中用豆粕部分替代魚粉，可改善魚體抗氧化能力，且在適當替代范圍內抗氧化能力的改善程度與替代比例間存在同步性，但替代量過高后豆粕自身含有的抗營養因子除了會影響魚類消化能力外，也會引起機體的免疫反應或是炎癥的產生，進而抑制魚體非特異性免疫性能，這與對斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)[21]及中華鱉(TrionyxSinensis)[24]的研究結果一致。

4 結論

本研究中，以豆粕替代20%魚粉蛋白時，能顯著提高點帶石斑魚的生長性能又不會對點帶石斑魚的消化酶活性及抗氧化能力產生明顯影響；而且從生長性能、消化酶和抗氧化能力不受影響的角度考慮，點帶石斑魚飼料中豆粕替代魚粉蛋白的比例不宜超過20%。