小麥籽粒中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的檢測及分布研究

劉堅 毛紅霞

【摘要】本文將小麥籽粒制成的全麥粉、小麥粉和干面筋作為分析對象，建立免疫親和高效液相色譜分析全麥粉、小麥粉和干面筋中脫氧雪腐鐮刀茵烯醇（DON）的檢測方法，研究DON在分析對象中的分布變化規律。該方法采用免疫親和柱凈化，以甲醇：乙腈：水=10：10：80（V/V/V）為流動相，進樣量100μL，回收率為74.7%～104.9%，相對標準偏差6.4%～12.3%，線性關系r值0.9995，方法檢出限25μg/kg。檢測分析結果顯示，小麥制成小麥粉后相比較全麥粉，DON含量降低了88.4%～95.3%，制成千面筋后未檢出DON。

【關鍵詞】高效液相色譜；脫氧雪腐鐮刀茵烯醇；全麥粉；小麥粉；干面筋

當今，食品安全是人類關注的焦點，而小麥作為國人的日常基礎口糧和其他食品的原料，其質量安全又尤為顯得重要。據有關調查研究顯示，小麥易被禾谷鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、黃色鐮刀菌等多種鐮刀霉菌污染，產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）。小麥中檢出DON的機率大多數超過了50%，部分國家和地區甚至已經達到了100%，小麥的衍生副產品中也檢出了DON。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是一類嘔吐毒素，常常被稱為“嘔吐毒素”。該毒素具有一定的毒性，影響動物的生長和食物的吸收。家禽類動物或人類誤食后可能引起嘔吐、腹瀉、內毒素血癥，嚴重的甚至造成血小板缺乏癥和神經系統紊亂。因此，我國《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》（GB 2761-2017）中規定了小麥、小麥粉中DON含量不得超過1000μg/kg。

目前DON的分析檢測方法有薄層色譜法、酶聯免疫吸附法、高效液相色譜法等。但是薄層色譜法和酶聯免疫吸附法均存在靈敏度差和重復性差的問題。高效液相色譜法由于前處理條件和儀器分析條件的差異，檢測的準確性和靈敏度都有較大的差距，本文建立免疫親和柱凈化的前處理方法，建立用甲醇：乙腈：水=10：10：80（V/V/V）三元流動相體系，100μL大體積進樣分析DON的新方法，分析檢測全麥粉、小麥粉和干面筋中的DON含量，查找DON在小麥中的分布規律，優化小麥的商業用途，對保護人類食品安全有重大意義。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

Agflent 1100液相色譜儀（配紫外檢測器）：安捷倫公司；粉碎機：成都施特威公司；小型實驗磨：德國布拉本德公司；面筋儀：瑞典波通公司；電加熱干燥器：瑞典波通公司；高速均質器：飛利浦公司；玻璃纖維濾紙：英國Whatman公司；6位空氣泵操作架：北京中檢維康公司；電子天平：梅特勒公司；氮吹儀：無錫沃信公司；免疫親和柱：美國Vicam公司。

色譜純甲醇：中國國藥；色譜純乙腈：中國國藥；聚乙二醇PEG8000：美國Vicam公司；超純水：美國Millipore公司。

嘔吐毒素標準儲備溶液（純度大于99.5%）：200.3μg/mL。

嘔吐毒素標準工作溶液：取適量體積嘔吐毒素標準溶液，氮氣儀吹干后，用流動相（甲醇+乙腈+水/10+10+80）分別配制濃度為100μg/mL、300μgL、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L、4000μg/L、6 000μg/L的DON標準工作溶液。

1.2試驗樣品

全麥粉：將小麥顆粒除雜后粉碎至80%以上過20目篩，篩上物和篩下物混勻制成全麥粉。小麥粉：將小麥顆粒除雜后用小型實驗磨制成小麥粉。干面筋：按照GB/T 5506.2-2008和GB/T 5506.4-2008，將小麥粉洗成淡黃色的濕面筋，將濕面筋用電加熱干燥器烘干后，即制成了干面筋，樣品前處理時磨成粉末。

1.3樣品處理

1.3.1樣品制備

按照1.2制備試驗樣品。

1.3.2樣品提取

稱取25g試驗樣品和5g聚乙二醇PEG8000，用100mL乙腈水（80/20）溶于均質器中，以10000r/min的速度均質2min，靜置2min，用玻璃纖維濾紙過濾提取溶液，收集澄清濾液于50mL比色管中。

1.3.3樣品凈化

連接免疫親和柱于玻璃注射器下，準確移取2mL混勻的濾液于玻璃注射器中，連接空氣泵和玻璃注射器，調節空氣壓力，使溶液以約1滴/s～2滴，s的速度通過免疫親和柱，直至空氣完全進入到免疫親和柱中。用5mL高純水淋洗免疫親和柱，流速保持在1滴/s～2滴/s的速度，直至空氣完全通過免疫親和柱。準確加入1.0mL色譜純甲醇到玻璃注射器中，淋洗免疫親和柱并收集1.0mL全部樣品洗脫液于玻璃測試管中。

1.3.4提取液定容

將1.0mL洗脫液用氮氣儀吹干后，用300μL流動相（甲醇+乙腈+水/10+10+80）定容洗脫液，進高效液相色譜儀分析測定。

1.4儀器條件

色譜柱：AgilentC18 5μm4.6mmx250mm；流動相：甲醇：乙腈：水（V/V，10：10：80）；流速：0.8mL/min；進樣量：100μL；柱溫：30℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：218nm。

2結果與討論

2.1試驗條件的優化

2.1.1免疫親和柱吸附能力的優化

DON免疫親和柱對DON具有特異吸附性，當樣品提取液通過親和柱，樣品中的DON會和親和柱中的特異性抗體結合，而提取液中的其它組分或雜質不會與親和柱結合，將隨洗脫液流出，實現對提取液中DON的凈化提取。免疫親和柱凈化技術雖然具有強特異性、高靈敏度、高回收率等特性，但是免疫親和柱中的抗體是一定量的，一旦通過免疫親和柱的樣品量過大，無法保證樣品提取液中DON完全被吸附，從而造成回收率較低。對免疫親和柱進行不同含量嘔吐毒素標準樣品的吸附回收率試驗，具體見圖1。從圖1中可知，免疫親和柱的最高吸附DON的容量是1200ng左右，當樣品中DON含量超過免疫親和柱的最大吸附容量時，超過最大吸附容量的部分會流出親和柱，導致回收率降低。

2.1.2流動相、流速和進樣體積的優化

分別以三種不同的流動相甲醇水（V/V，40：60）、甲醇乙腈水（VN/V，10：10：800、乙腈水（v/v，dO：60）進行液相分析。實驗結果顯示，以甲醇/乙腈/水（V/V/V，10：10：80）為流動相時，很好地將雪腐鐮刀菌烯醇和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進行了分離，有效避免了雜質的干擾，其色譜峰的峰形優于其它流動相的峰形，無拖尾現象。同時隨著流動相的流速增大，保留時間相應縮短，但峰形集中，柱前壓較大，影響分離柱的使用壽命，0.8mL/min的流速完全能保證DON的分離。另外，大多數情況下使用20～50μL作為樣品上機分析的體積，本實驗將進樣體積提高至100μL，既可以保證樣品的峰形對稱，又可以提高樣品的檢出限，因此將100μL定位樣品的上機體積。在該條件下，標準品和樣品的色譜圖見圖2和圖3。

2.1.3樣品洗脫液的優化

洗脫液直接以甲醇洗脫后的溶液進樣分析，發現DON沒有達到完全分離，出峰受到了干擾，甲醇洗脫定容后用氮氣吹干，再用300μL流動相進行定容，樣品中嘔吐毒素的峰可與其他組分實現完全分離，不受其他組分峰型的干擾，且提高了方法的靈敏度。

2.2方法的線性范圍與方法的檢出限

在規定的色譜條件下，測定系列DON標準溶液，用峰面積對標準溶液中的質量濃度（100μg/L、300μg/L.500μg/L、1000pμg/L.2000pμg/L、4000μg/L、6000pμg/L）進行定量作圖。DON標準溶液濃度從100μg/L遞增到6000μg/L時，DON濃度和峰面積之間存在良好的線性關系，相關系數0.999 5。線性方程Y=71.023X+9.483 9（Y表示峰高；x表示DON含量，μg/L）。免疫親和大體積進樣的高效液相色譜法大大提高了檢測靈敏度，采用逐級稀釋法分析方法的檢出限，根據信噪比為3的峰響應值，檢出限為25μg/kg，信噪比為10的峰響應值為定量限，即60μg/kg。該方法完全可以滿足檢測國家標準對小麥及其制品中DON的最大限量要求。

2.3方法的回收率實驗

取全麥粉、小麥粉和干面筋樣品各1份空白樣品，分別做200μg/kg、600μg/kg、1500μg/kg3個濃度水平的加標回收實驗，每個濃度水平做8平行測定，結果見表1，回收率在74.7%～104.9%，RSD在6.4%～12.3%。

2.4樣品的檢測

隨機扦取14份小麥樣品，按照1.2操作制備相對應的全麥粉、小麥粉和干面筋各14份，按照前處理1.3和儀器條件1.4檢測樣品，檢測結果見表2和圖4。

3結論

（1）采用大體積進樣、免疫親和柱凈化的高效液相色譜法檢測小麥籽粒（全麥粉、小麥粉和干面筋）樣品中，嘔吐毒素方法的檢出限25μg/kg，定量限60μg/kg，回收率在74.7%～104.9%，RSD在64%～12.3%。該方法簡便快速、準確可靠、靈敏度高、重現性好，是檢測小麥籽粒樣品中嘔吐毒素可靠有效的方法。

（2）試驗結果顯示，受嘔吐毒素污染的小麥籽粒，不同部位污染程度有較大差異。嘔吐毒素在小麥中含量分布很不均勻。麩皮中最高，小麥粉其次，干面筋中未檢出嘔吐毒素。全麥粉中嘔吐毒素檢出含量在608.1μg/kg～3356.5μg/kg；小麥粉中嘔吐毒素檢出的含量普遍較低，在62.7μg/kg～346.4μg/kg，嘔吐毒素含量降低了88.4%～95.3%，且均未超過衛生標準允許量（≤1000μg/kg）；小麥粉洗成干面筋后，未在干面筋中檢出嘔吐毒素。可見，全麥粉中嘔吐毒素的含量是小麥粉中嘔吐毒素的10倍，嘔吐毒素污染主要集中在小麥的麩皮層中。