TP53在胃癌組織中的表達及臨床意義

周展新 尹曉華 謝黎明 葉東梅 肖玄 李娜 張志偉

[摘要]目的：選取課題組前期鑒定的胃癌相關蛋白質TP53，了解該蛋白在胃腺癌組織中的表達情況，并分析其臨床意義。方法：采用胃癌組織芯片結合免疫組織化學染色分析TP53蛋白在胃癌組織中的表達。依據(jù)免疫組織化學染色檢測胃癌組織中的表達結果，結合患者的臨床資料，分析TP53蛋白表達與臨床資料兩者間的意義。結果：1、TP53蛋白主要表達于細胞核，其在不同組織中的表達率分別為正常胃粘膜2.82%、癌旁組織18.43%、胃癌62.39%、淋巴結轉移癌組織80.23%。胃癌組織中的陽性表達率分別為高分化腺癌54.22%、中分化腺癌62.5%、低分化腺癌79.49%。2、胃腺癌與淋巴結轉移癌組織中TP53蛋白呈現(xiàn)高表達，且明顯較正常胃粘膜及癌旁組織中表達高（p<0.01）。癌旁與正常胃粘膜組織中TP53蛋白呈現(xiàn)低表達，但癌旁組織中表達較正常胃粘膜組織高（P<0.01）。3、胃腺癌組織分化程度的降低，TP53蛋白陽性表達率逐漸增加（P<0.Ol）。TP53蛋白在胃腺癌組織中的表達與組織分化程度呈負相關，而與TNM分期及淋巴結轉移呈正相關（P[關鍵詞]胃癌；TP53蛋白；蛋白表達；臨床意義

胃癌（Gastric carcinoma，GC）是我國人群中發(fā)病率與死亡率為第二位的惡性腫瘤，居消化道腫瘤之首[1-3]。最近，我國胃癌的發(fā)生率逐年降低，仍是嚴重威脅人們健康與生命的常見惡性腫瘤[4，5]。因為胃癌部位隱蔽，早期癥狀不明顯，許多患者就診時已發(fā)展為晚期，臨床療效差，所以胃癌早期診斷對其防治顯得十分重要，提高其早期診斷依賴于新的技術發(fā)現(xiàn)。本研究選取課題組前期鑒定的胃癌相關蛋白質TP53[6]，進一步觀察其在胃癌組織中的表達情況與臨床意義，將為胃癌的診斷與鑒別，以及評估患者預后等提供相關的參考資料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料 收集2013年5月到2016年5月237例南華大學附屬第一醫(yī)院胃癌手術切除標本，其中男性患者175例，女性患者62例；最大年齡者86歲，最小者27歲，平均年齡60歲；發(fā)生淋巴結轉移患者169例，無轉移患者68例；依據(jù)2010年版WHO分級標準，其中高分化腺癌者39例，中分化腺癌者113例，低分化腺癌者85例。按2009年版UICC/AJCC分期方案，其中I期33例，Ⅱ期55例，III135例，Ⅳ14例。另外，選取癌旁組織（距腫塊2cm以內(nèi)組織，為腸上皮化生，非典型性增生，粘膜慢性炎癥）237例，選取正常組織（距腫塊10厘米以上組織，可伴輕度炎癥細胞浸潤，無腸上皮化生及非典型性增生）148例，選取轉移淋巴結組織（淋巴結中見癌組織）88例?；颊咝g前均未接受過放化療，所有組織均經(jīng)病理確診組織學類型。

1.1.2 主要試劑 實驗所用的TP53蛋白鼠抗與羊抗鼠二抗為Santa Cruz公司產(chǎn)品。S-P免疫組化與DAB檢測試劑盒購自福建邁新生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 參考S-P免疫組化試劑盒說明書步驟進行操作，實驗設立陽性與陰性對照（陽性對照由公司提供，陰性對照設置由PBS代替一抗體）。具體操作步驟如下：二甲苯進行組織芯片充分脫蠟，PBS浸泡；經(jīng)梯度酒精水化，加熱抗原修復，PBS浸泡，過氧化物酶孵育，PBS浸泡，血清封閉，TP53蛋白一抗（1：500）4℃孵育過夜，PBS浸泡，二抗（1：1000） 37℃孵育15min.PBS浸泡，生物素蛋白一過氧化物酶抗體孵育，PBS浸泡，經(jīng)DAB孵育組織顯色，蘇木素細胞核復染，鹽酸乙醇分化，返藍、脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察染色情況及陽性反應部位。

1.2.2 結果的判別 觀察組織芯片中染色情況，組織中蛋白表達顯色部位與陽性表達細胞數(shù)。蛋白表達染色情況分為黃色、棕色及棕褐色。蛋白表達顯色部位為細胞核。觀察TP53蛋白表達的陽性細胞數(shù)，通過隨機選取每個芯片組織塊5個不同視野，對視野中表達陽性細胞和所有細胞分別進行計數(shù)，每個視野重復計數(shù)三次，取5個視野平均值代表相應細胞數(shù)，計算蛋白在組織中的陽性表達率。依據(jù)蛋白表達染色強度與陽性表達率綜合分值分析，蛋白表達染色強度計分，其中1分表示無色，2分表示黃色，3分表示棕褐色；陽性表達率計分，其中<10%計1分，11%-50%計2分；>50%計3分。綜合分值—蛋白質染色強度計分×陽性表達率計分，其中1分為陰性“一”，2-4分為陽性“+”，>6分為強陽性“+++”，另外，視野中陽性細胞比例超過10%則表示為陽性。

1.2.3 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析，蛋白表達與不同臨床病理資料分析用x2檢驗和方差分析，TP53蛋白表達的組間相關性分析用Spearman秩檢驗進行分析比較，以P<0.05表示資料分析差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TP53蛋白在胃癌組織中的表達情況 免疫組織化學染色結果顯示，TP53蛋白表達于細胞核中，其在正常胃粘膜陽性表達率為2.82%、癌旁組織為18.43%、胃腺癌為62.39%、淋巴結轉移癌為80.23%。胃腺癌與淋巴結轉移癌組織中TP53蛋白呈現(xiàn)高表達，且明顯較正常胃粘膜及癌旁組織中表達高（P<0.01）。癌旁與正常胃粘膜組織中TP53蛋白呈現(xiàn)低表達，但癌旁組織中表達較正常胃粘膜組織高（P<0.01）。TP53蛋白在高分化腺癌陽性表達率為54.22%、中分化腺癌為62.5%、低分胃腺癌為79.49%，隨著胃腺癌分化程度的降低，TP53蛋白的陽性表達率則逐漸升高，胃腺癌組織分化程度的降低，TP53蛋白陽性表達率逐漸增加（P<0.01）。

2.2 TP53蛋白表達的臨床意義結合臨床病理資料結果分析，隨著胃癌的演進TP53蛋白表達在組織中的變動不斷升高，即在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中TP53蛋白陽性表達率逐漸增加。另外，TP53蛋白表達與患者年齡、性別、腫瘤大小均無關，其在胃腺癌組織中的表達與組織分化程度呈負相關，而與TNM分期及淋巴結轉移呈正相關（P<0.01）。

3 討論

目前，胃癌的發(fā)病機制研究及臨床療效方面取得了一定的成效，但早期診斷與治療仍是改善胃癌療效的重要舉措，早期診斷依賴于靈敏與特異性高的診斷技術發(fā)現(xiàn)。尋找胃癌診斷特異與敏感蛋白質，對患者早期診斷與治療意義重大，也對胃癌的防治具有深遠的臨床意義。經(jīng)大量的研究后，人們歸納腫瘤標志物主要分為細胞表面相關標志物、血清相關標志物以及基因相關標志物三大類[7]。為了獲取新的有價值的胃癌相關蛋白質，課題組前期從正常胃粘膜、癌旁（非典型增生、腸上皮化生組織）、胃腺癌及淋巴結轉移癌組織中，篩選與鑒定了包括TP53蛋白在內(nèi)的243個胃癌相關蛋白質，進一步分析所獲相關蛋白質在胃腺癌組織中的表達意義，生物學功能及表達與調(diào)節(jié)機制等可為挖掘胃癌發(fā)病的分子機制提供理論依據(jù)。因此，本研究通過組織芯片大樣本檢測相關蛋白質的表達情況，分析其表達情況及臨床意義。

TP53是一種重要的抑瘤基因，該基因定位于染色體17p13.1區(qū)域，含有11個外顯子，編碼53kD的蛋白質p53，其由393個氨基酸殘基組成[8]。p53蛋白是人體細胞中非常重要的核轉錄因子，被稱為“基因守護者”[7]。TP53在細胞內(nèi)主要通過監(jiān)測Gl和G2/M檢測點調(diào)節(jié)細胞周期，與其轉錄激活密切相關[10]。野生型p53蛋白含量低，半衰期短，容易水解，一般情況下無法檢測到。然而，突變型p53蛋白不易被水解，在細胞內(nèi)不斷積聚，容易檢測。突變型p53蛋白則喪失了原有蛋白的抑癌作用，并獲得了一系列癌基因的功能，如促進細胞惡性轉化，加快細胞的生長增殖，誘導細胞產(chǎn)生耐藥等。

許多研究發(fā)現(xiàn)，TP53基因在多種惡性腫瘤中發(fā)生基因突變，如肺癌、肝癌、結直腸癌等。目前，發(fā)現(xiàn)TP53基因的點突變至少有3500種，在腫瘤中的突變?nèi)Q于種類、性質與位置，其點突變以錯義突變?yōu)橹?，其突變位點主要包括175、248、249、273與282等氨基酸位點，產(chǎn)生突變體蛋白。有研究顯示，TP53在肺腺癌組織中突變率為63.3%，與腫塊大小和病理分期有關。TP53基因突變情況是判斷淋巴瘤和血液病預后的重要指標之一，突變者預后差，容易復發(fā)與耐藥等[6]。本研究檢測為突變型TP53蛋白，其在胃癌及淋巴結轉移癌組織中呈現(xiàn)高表達，其表達與胃癌的分化程度、腫瘤的TNM分期及淋巴結轉移呈正相關，提示TP53基因在胃癌組織中喪失了抑瘤基因功能，扮演著促進細胞增殖作用。與其他腫瘤檢測相似，檢測TP53表達有助于胃癌組織的鑒別。

總之，本文通過運用胃癌組織芯片結合免疫組織化學染色分析了TP53蛋白在胃腺癌組織中的表達，以及與臨床病理資料間的關系，明確了檢測TP53蛋白表達有助于胃癌診斷的鑒別。證實了TP53蛋白在胃癌及淋巴結轉移癌組織中高表達與胃癌的發(fā)生和組織學類型有關。本文為獲取有價值的胃癌診斷相關蛋白質提供了有利的實驗資料與依據(jù)，也為深入挖掘胃癌發(fā)病的分子機制提供了新的思路。

參考文獻

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