豬葡萄球菌感染BALB/c小鼠血清中細胞因子表達的抗體芯片分析

李 艷，王 磊，蔡汝健，蔣智勇，勾紅潮，楚品品，宋 帥，李春玲

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站，廣東 廣州 510640）

仔豬滲出性皮炎（exudative epidermit, EE）是由葡萄球菌感染引起的一種急性傳染病，仔豬感染后會出現(xiàn)全身性皮炎，最終導(dǎo)致脫水和全身衰竭而死亡，死亡率可達70%［1-2］。該病的發(fā)生給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，丹麥、日本、德國、俄羅斯等國家也有該病發(fā)病及病原的研究［3-6］。豬葡萄球菌可分為有毒力型和無毒力型菌株，其分泌的脫落毒素是主要的毒力因子［7-8］。目前已有5種豬葡萄球菌分泌的表皮脫落毒素被發(fā)現(xiàn)并命名，分別是丹麥學(xué)者鑒定的ExhA、ExhB、ExhC和ExhD，以及日本學(xué)者鑒定的SHETB［9-10］。

已有研究顯示，炎性細胞因子在疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［11］。同時檢測多種炎性細胞因子的表達水平將有助于深入了解豬葡萄球菌的感染過程，而且有可能發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的致病性因子。抗體芯片技術(shù)是一種檢測生物樣品中蛋白表達模式的方法，其憑借高通量、高靈敏度、高特異性和低樣本量等特點，為蛋白質(zhì)表達的快速、平行分析提供了技術(shù)平臺［12］。此外，抗體芯片對疾病相關(guān)生物標簽的發(fā)現(xiàn)、藥物靶點的篩選等具有重要作用［13-15］。

本研究通過抗體芯片技術(shù)檢測了豬葡萄球菌感染BALB/c小鼠后血清炎性細胞因子的表達，旨在研究炎性細胞因子在豬葡萄球菌感染過程中的作用，同時篩選可能的疾病相關(guān)生物標簽。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株CF-1（JQ728492）分離自廣東省暴發(fā)滲出性皮炎的某豬場病豬；AAM-CYT-G2炎癥因子抗體芯片購自廣州RayBiotech公司；4周齡BALB/c小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)。

1.2 試驗方法

1.2.1 血清采集 將4周齡BALB/c小鼠24只隨機分為2組，每組12只。試驗組的每只小鼠經(jīng)肌肉和皮下注射菌液0.2 mL（CF-1含量1.0×108CFU），對照組的小鼠注射滅菌的PBS液。均在注射后24、48 h采集血液，收集血清，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細菌的分離鑒定 無菌條件下，采集小鼠的內(nèi)臟，分別接種于血瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，次日挑取單個菌落進行染色鏡檢，并進行劃線純培養(yǎng)。

1.2.3 血清細胞因子的檢測 血清細胞因子的檢測采用RayBiotech Mouse Cytokine Antibody Array G Series 5 芯片技術(shù)測定（含RayBiotech公司原裝試劑盒），AAM-CYT-G2芯片布局見表1。將玻片芯片取出，每張玻片4個樣本實驗區(qū)，每個樣本實驗區(qū)的微陣列中固定了32種細胞因子的抗體及陽性和陰性對照，每個細胞因子位點重復(fù)測定2次。主要操作步驟如下：（1）每個芯片孔中加入100 μL封閉液，封閉30 min。抽去封閉液，每孔加入100 μL樣品，每個陣列1個樣品，孵育過夜。（2）使用Thermo Scientific Wellwash Versa 芯片洗板機清洗玻片，每孔加入250 μL洗液Ⅰ，清洗6次；每孔加入250 μL洗液Ⅱ，清洗5次。（3）加入70 μL生物素標記抗體，孵育1 h，清洗玻片同步驟（2）。（4）每孔加入70 μL熒光素標記的鏈霉抗生物素蛋白，在室溫下避光孵育1～2 h，清洗玻片同步驟（2）。（5）采用GenePix 4000B Microarray Scanner激光掃描儀掃描芯片，用AAM-CYT-G2數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

表1 AAM-CYT-G2芯片膜上細胞因子位置

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用微陣列（SAM）軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，差異值≥2.0倍表明細胞因子的表達上調(diào)顯著，差異值≤0.5倍表明細胞因子的表達下調(diào)顯著，細胞因子的表達在0.5～2倍之間表明無顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離鑒定

細菌在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和綿羊鮮血平板培養(yǎng)基上生長良好，菌落形態(tài)光滑濕潤，呈瓷白色；在血平板上不溶血，在麥康凱培養(yǎng)基上不能生長。通過顯微鏡觀察到藍紫色葡萄狀球菌（圖1，封三）。

2.2 不同處理小鼠血清細胞因子的差異表達

2.2.1 感染后24 h血清細胞因子的表達 感染后24 h試驗組與對照組的小鼠血清細胞樣本芯片掃描結(jié)果如圖2（封三）所示。芯片掃描結(jié)果顯示，與對照組相比，試驗組中共有5個血清細胞因子表達出現(xiàn)了顯著性變化，其中表達升高2倍以上的細胞因子有4個，包括G-CSF、IL-6、KC和MCP-5，IL-12的表達低于對照組一半。由表2可知，試驗組血清中G-CSF、IL-6、KC和MCP-5的表達分別為對照組的3490.13、9.98、44.25、7.05倍，IL-12的 表 達量為對照組的0.49倍。

2.2.2 感染后48 h血清細胞因子的表達 感染后48 h試驗組與對照組的小鼠血清細胞樣本芯片掃描結(jié)果如圖3（封三）所示。芯片掃描結(jié)果顯示，與對照組相比，血清細胞因子中共有4個細胞因子表達出現(xiàn)了顯著性變化，其中表達升高2倍以上的細胞因子有3個，包括G-CSF、KC和MCP-5；IL-12的表達同樣低于對照組一半。由表2可知，試驗組血清中G-CSF、KC和MCP-5的表達分別為對照組的1423.58、3.78、3.44倍，IL-12的表達量僅為對照組的0.47倍。

2.3 CF-1感染BALB/c小鼠后小鼠血清細胞因子差異表達

CF-1感染BALB/c小鼠后24、48 h，血清細胞因子芯片掃描（圖2、圖3，封三）及差異表達分析結(jié)果（表2）顯示，感染后24、48 h有3種細胞因子表達水平均升高2倍以上，分別為G-CSF、KC和MCP-5；表達水平均低于對照一半的細胞因子為IL-12。

表2 細胞因子差異表達變化倍數(shù)

3 結(jié)論與討論

近年來，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)譜分析、新藥研發(fā)、藥物靶標識別、臨床診斷及預(yù)后標記篩選。抗體芯片作為最常用的一種蛋白質(zhì)芯片，具有全面準確反映疾病發(fā)生、發(fā)展過程中蛋白質(zhì)表達水平等特點，已成為生物樣品中蛋白質(zhì)分子檢測的重要手段［16］。細胞因子是炎癥性疾病的重要調(diào)節(jié)因子，是目前發(fā)病機制研究的熱點之一［17-18］。豬葡萄球菌感染過程中可能涉及免疫系統(tǒng)的異常激活和抑制以及促炎/抗炎反應(yīng)等，單一細胞因子檢測不能為疾病的進展情況提供可靠信息，系統(tǒng)細胞因子檢測如細胞因子抗體微陣列技術(shù)能提供全面的細胞因子表達數(shù)據(jù)。細胞因子抗體芯片研究現(xiàn)已應(yīng)用于糖尿病、腫瘤、心血管疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病研究［19-20］，因此我們使用細胞因子抗體芯片技術(shù)檢測感染豬葡萄球菌CF-1株BALB/c小鼠血清中細胞因子的表達，了解豬葡萄球菌感染過程中炎性細胞因子表達的相關(guān)性。在本研究中，使用小鼠細胞因子抗體微陣列技術(shù)同時檢測32種細胞因子，并篩選了5種具有顯著差異的細胞因子，其中4個細胞因子（G-CSF、IL-6、KC、MCP-5）在豬葡萄球菌感染小鼠血清中上調(diào)表達，IL-12在豬葡萄球菌感染的小鼠的血清中下調(diào)表達。在前期研究報道中，我們采用細胞因子抗體芯片技術(shù)檢測了豬葡萄球菌ZC-4株感染BALB/c小鼠血清中細胞因子的表達［21］，發(fā)現(xiàn)了4種具有顯著差異的細胞因子，其中G-CSF、IL-6及KC上調(diào)表達，下調(diào)表達的是IL-12。綜合豬葡萄球菌ZC-4株和CF-1株感染小鼠血清細胞因子差異表達結(jié)果，篩選豬葡萄球菌感染小鼠血清差異表達細胞因子，其中表達上調(diào)的細胞因子為G-CSF、IL-6及KC，下調(diào)表達的是IL-12。提示這些細胞因子有可能作為豬葡萄球菌感染血清的蛋白分子標記物。

IL-6主要由巨噬細胞產(chǎn)生，在免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)、炎癥感染反應(yīng)、骨髓組織造血功能調(diào)控等方面具有多效性。IL-6是一種非常重要的炎癥因子，參與炎癥和免疫反應(yīng)，在慢性炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮病理作用［22］。本研究中促炎因子IL-6在感染早期表達顯著升高，暗示在豬葡萄球菌感染早期的炎癥過程中發(fā)揮了主要作用。粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF）是一種多肽鏈的細胞生長因子。近年來，已發(fā)現(xiàn)G-CSF不僅特異性地調(diào)節(jié)粒細胞的增值和分化，而且還增強了成熟粒細胞的功能，同時具有免疫調(diào)節(jié)、血管保護、抗動脈粥樣硬化和保護神經(jīng)作用［23］。G-CSF通過調(diào)節(jié)多種免疫細胞來影響機體的免疫反應(yīng)［24］。KC也稱為CXCL1，屬于CXC趨化因子家族，CXC趨化因子參與細胞內(nèi)外多種生命活動，如炎性反應(yīng)、損傷修復(fù)等［25］，腫瘤組織中CXCL1的高表達與疾病的不良預(yù)后相關(guān)［24-26］。本研究中，G-CSF和KC的表達也顯著升高，其在豬葡萄球菌感染中的作用需要進一步研究。

本研究采用細胞因子抗體芯片技術(shù)獲得了一組非常有意義的數(shù)據(jù)，初步篩選了豬葡萄球菌感染小鼠后的血清蛋白標記物。同時，在篩選過程中發(fā)現(xiàn)，還有一些細胞因子可能在豬葡萄球菌的感染過程中起作用，為了解豬葡萄球菌感染的分子機制提供參考。

圖1 分離菌革蘭氏染色鏡檢結(jié)果（×100）

圖2 感染后24 h 血清AAM-CYT-G2細胞因子抗體芯片檢測結(jié)果

圖3 感染后48 h 血清AAM-CYT-G2細胞因子抗體芯片檢測結(jié)果