順鉑、5—氟尿嘧啶與塞來昔布聯合應用對胃癌細胞株SGC—7901凋亡行為的影響

翟崇宇 陳俊強 王震 黎伯培 毛遠天

【摘要】目的 研究臨床常用化療藥物順鉑、5-氟尿嘧啶及塞來昔布聯合應用模式對胃癌細胞株SGC-7901凋亡行為的影響，并分析上述藥物治療過程中可能涉及的分子機制。方法 采用AnnexinV-PE和7-AAD雙染模式予以流式細胞技術評定順鉑組、5-氟尿嘧啶組、順鉑+塞來昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來昔布組這些處理組胃癌細胞的凋亡行為情況。結果 流式細胞技術檢測結果表明，在藥物作用于胃癌細胞株SGC-79012天后，順鉑組、5-氟尿嘧啶組、順鉑+塞來昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來昔布組的細胞凋亡率分別為（7.10±0.30）%、（46.53±1.50）%、（39.17±1.10）%、（66.93±0.70）%、（62.13±1.60）%，均明顯高于參照組，數據存在差異有統計學意義（P<0.05）；同時發現：聯合5-氟尿嘧啶組、順鉑+塞來昔布組與順鉑組、5-氟尿嘧啶組相比，細胞凋亡率顯著增加，組間差異性顯著（P<0.05）。結論 與順鉑組、5-氟尿嘧啶組相比，順鉑+塞來昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來昔布組治療模式能夠促進胃癌細胞凋亡，這一研究結果顯示順鉑、5-氟尿嘧啶及塞來昔布聯合應用模式具有協同抗胃癌的作用。

【關鍵詞】胃癌；化療藥物；細胞凋亡；流式細胞技術

【中圖分類號】R735.2 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095-6681.2018.19..03

Effect of cisplatin，5-fluorouracil combined with celecoxib on the apoptosis of gastric cancer cell line SGC-7901

ZHAI Chong-yu，CHEN Jun-qiang*，WANG Zhen，LI Bo-pei，MAO Yuan-tian

（The first affiliated hospital of guangxi medical university，Guangxi Nanning 530021，China）

【Abstract】Objective To study the effect of chemotherapeutic drugs cisplatin， 5-fluorouracil and celecoxib on the apoptotic behavior of gastric cancer cell line SGC-7901， and to analyze the possible molecular mechanisms involved in the above drug treatment.Methods The apoptotic behavior of cisplatin group， 5- fluorouracil group， cisplatin + celecoxib group and 5- fluorouracil + celecoxib group were evaluated by flow cytometry with AnnexinV-PE and 7-AAD double staining mode. Results Flow cytometry results showed that after the drug was applied to the gastric cancer cell line SGC-79012， the cells of the cisplatin group， 5-fluorouracil group， cisplatin+celecoxib group， and 5-fluorouracil+celecoxib group were observed. The apoptotic rates were（7.10±0.30）%，（46.53±1.50）%，（39.17±1.10）%，（66.93±0.70）%，and（62.13±1.60）%，respectively， which were significantly higher than the reference group.The data were statistically significant（P<0.05）；found at the same time： combined 5-fluorouracil group， cisplatin +celecoxib group and cisplatin group，5-fluorouracil group， the rate of apoptosis significantly increased， the difference between the groups was significant（P<0.05）.Conclusion Compared with the cisplatin and 5-fluorouracil groups， the cisplatin+celecoxib group and the 5-fluorouracil+celecoxib group can promote gastric cancer cell apoptosis.This result showed that cisplatin，5- The combination of fluorouracil and celecoxib has a synergistic anti-gastric effect.

【Key words】Gastric cancer；Chemotherapy；Apoptosis；Flow cytometry

胃癌（gastric carcinoma）是我國常見的惡性腫瘤，多發于年齡50歲以上的男性。據不完全統計，我國每年新發胃癌病例大約在42.7萬，而每年死亡病例約30萬[1]，現已成為我國發病率和死亡率最高的惡性腫瘤。胃癌早期無明顯癥狀，可存在輕微腹部不適，臨床誤診和漏診幾率大。而大多數胃癌在確診時已相對嚴重，導致無法單純使用手術進行治療。為此，如何尋找胃癌的侵襲轉移機制，對于提高胃癌對化療藥物的敏感性以及臨床效果非常重要。既往研究顯示，環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和胃癌的侵襲轉移過程有直接的關系。其誘導生成的前列腺素E2（PGE2）可在一定程度上與相關受體進行結合，從而促進Bcl-1基因的表達，達到抑制E-鈣黏蛋白表達的目的，減少胃癌細胞的凋亡[2]。近期有研究顯示，COX-2的選擇性抑制劑塞來昔布可有效地抑制胃癌細胞中COX-2的表達同時可以在憶當年程度上抑制胃癌細胞的增殖和促進其凋亡[3]。基于此，本次研究通過細胞流式技術觀察順鉑與5-氟尿嘧啶同塞來昔布聯合應用對胃癌細胞株SGC-7901凋亡行為的影響，并探討其可能涉及的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞材料

人胃癌細胞株SGC7901材料于中南大學湘雅細胞庫采購。

1.2 儀器與材料

RPMI-1640培養液與標準胎牛血清（Gibco，USA）；青霉素-鏈霉素混合液（碧云天公司，中國上海）；順鉑（齊魯制藥有限公司，中國）；5-氟尿嘧啶及塞來昔布（Aladdin，USA）；細胞凋亡檢測試劑盒（BD，USA）；二甲基亞砜（DMSO）（Solarbio，USA）；PBS磷酸鹽緩沖液（干粉）（索萊寶科技有限公司，中國北京）；CO2細胞培養箱（Thermo Forma，USA）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，中國）；細胞培養瓶及吸管（Corning，USA）；電熱恒溫

水浴箱（上海醫療器械廠，中國）；流式細胞儀（BD，USA）。

1.3 方法

1.3.1 胃癌細胞SGC-7901的培養及藥物處理

（1）將冷凍儲存的胃癌細胞株SGC-7901，在1分鐘內予以溶解，將胃癌細胞株SGC-7901溶解懸液置入培養基之中，并吹勻，以800 rpm進行離心處理，時間約為3分鐘。

（2）保留胃癌細胞株SGC-7901懸液沉淀，應用培養基再次制備成為懸液，同時根據胃癌細胞的具體狀態，將5滴細胞懸液與4 ml培養基進行水平十字混合，保持37℃之中培養24小時。

（3）用1×PBS清洗細胞后更換培養基，混入約6 ml新鮮的細胞培養基，一般每24～48 h更換一次。

（4）采用電子顯微鏡觀察胃癌細胞株SGC-7901，如胃癌細胞占屏80%以上后，進行傳代。

（5）細胞懸液混合新培養基進一步培養。

（6）觀察細胞生長狀態，待細胞生長狀態良好后，將其分為五個實驗組（參照組、順鉑組、5-氟尿嘧啶組、順鉑+塞來昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來昔布組），同時建立6個藥物濃度梯度[4，5]對各組細胞分別進行的藥物作用處理。找到順鉑組、5-氟尿嘧啶組及塞來昔布組的半數抑制濃度分別為10.43±0.27 mg/L、156.56±2.07 mg/L、92.04±4.93 umol/L。

1.3.2 流式細胞技術檢測不同藥物治療模式下胃癌細胞株SGC-7901凋亡情況

將各組經半數抑制濃度作用24 h后的胃癌細胞株SGC-7901采用0.25%的胰酶進行消化，檢測中可在消化時混入2%牛血清白蛋白，避免消化過度而導致檢測結果存在偏差。在標記前用1×緩沖液清洗胃癌細胞，去除細胞中的牛血清白蛋白，保證檢測結果準確性。

a.將貼于培養皿壁的胃癌細胞取下，于室溫條件下進行離心處理，轉速：2000 rpm時間：5～10分鐘；

b.再次用1×緩沖液清洗胃癌細胞，于室溫條件下進行離心處理，轉速：2000 rpm時間：5～10分鐘；

c.將300 μl1×緩沖液與細胞混合；

d.采用5 μlAnnexin V-FITC試劑與細胞懸液充分混合，室溫下靜置15～20分鐘（需予以避光處理）；

e.應用200 μl1×緩沖液與細胞懸液充分混合；

f.將5 μlPI制劑與細胞懸液充分混合，予以檢測。

1.4 統計學處理

數據納入SPSS 22.0統計軟件分析，計數資料采用x2檢驗，采用例數（n）百分數（%）表示，計量資料行t檢驗，以“x±s”表示，以P<0.05差異有統計學意義。

2 結 果

參照組、順鉑組、5-氟尿嘧啶組、順鉑+塞來昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來昔布組胃癌細胞株SGC-7901凋亡率分別為（7.10±0.30）%、（46.53±1.50）%、（39.17±1.10）%、（66.93±0.70）%、（62.13±1.60）%；與參照組相比，各組凋亡率明顯增加（P<0.05），且順鉑+塞來昔布組、5-氟尿嘧啶+塞來昔布組與順鉑組、5-氟尿嘧啶組相比，細胞凋亡率明顯增殖（P<0.05）。（表1、圖1、圖2）

3 討 論

順鉑和5-氟尿嘧啶藥品是臨床常用化療藥物，前者通過和腫瘤細胞中DNA結合，形成交叉鍵，進而對DNA復制行為起到了破壞作用。5-氟尿嘧啶藥物的胃癌細胞凋亡機制是通過藥物抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，從而使胃癌細胞DNA的合成行為受到抑制，促使胃癌細胞逐漸凋亡。但是，在臨床治療過程中，患者極易出現耐藥問題，致使胃癌患者化療效果難以保障，嚴重時甚至會造成患者化療失敗，嚴重威脅患者生命安全[6，7]。因此，應進一步研究胃癌臨床化療藥物對胃癌細胞的凋亡行為，以便于保證患者化療效果。塞來昔布藥物作為一種非特異性環氧化酶抑制劑，具有抗炎、解熱或鎮痛等臨床作用，也成為胃癌患者臨床治療的藥劑。

近年來，研究非特異性環氧化酶抑制劑在胃癌臨床治療中的研究成果較少，尤其是與化療藥物相互聯合應用方面。Tendo M、Yashiro M等人[8]采用胃癌腹膜轉移裸鼠模型化療藥物與非特異性環氧化酶抑制劑作用的影響，其結果顯示經口予非特異性環氧化酶抑制劑JTE-522與S-1聯合應用于胃癌腹膜轉移治療效果較好，說明非特異性環氧化酶抑制劑與S-1聯合應用模式具有臨床治療胃癌腹膜轉移的價值。Chen M、Yu L等人[9]研究結果表明，非特異性環氧化酶抑制劑能夠避免胃癌患者順鉑發生耐藥反應，但是在裸鼠移植瘤模型研究結果中顯示，塞來昔布和順鉑聯合模式的胃癌細胞株SGC-7901凋亡效果并未予以凸顯。鑒于此，究竟化療藥與COX-2抑制劑聯合應用能否提高胃癌的化療效果目前仍存在爭議。塞來昔布作為非特異性環氧化酶抑制劑的代表性藥物，其抗胃癌效果較為明顯。本研究結果顯示，與順鉑組、5-氟尿嘧啶組相比，順鉑+塞來昔布組、

5-氟尿嘧啶+塞來昔布組治療效果較好，藥物在聯合作用后能夠促進胃癌細胞株SGC-7901凋亡行為，抑制細胞增殖，增強藥物敏感性。

綜上所述，順鉑、5-氟尿嘧啶聯合塞來昔布用藥相較于單一用藥可以進一步促進胃癌細胞凋亡，但是否與P53、蛋白激酶A、AKT、Fas、Bcl-2/Bax、Bak、caspase-9等蛋白的表達調節及相關通路有關需進一步研究。

參考文獻

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[4] 張小茜，5-Fu聯合塞來昔布對胃癌的抑制作用及機制研究.2015，山東大學.

[5] 崔京遠，馬 紅，李 梅，et al.塞來昔布聯合順鉑對SGC-7901人胃癌細胞凋亡及Bcl-2表達的影響.中國現代普通外科進展[J]，2009，12（6）： 466-468.

[6] Kodera Y，Ishiyama A，Yoshikawa T， et al.A feasibility study of postoperative chemotherapy with S-1 and cisplatin （CDDP） for gastric carcinoma （CCOG0703）.Gastric Cancer [J]，2010，13（3）：197-203.

本文編輯：吳宏艷